Рентгеноструктурный анализ белко

Молекулярное строение белков удалось выяснить только недавно. Первый рентгеноструктурный анализ белка, миоглобина, был завершен в 1959 г., а структура первого фермента, лизоцима, была установлена в 1964 г. Исследования крупных ферментов, переносчиков электронов и антител, быстро прогрессируют. В настоящее время известна подробная картина молекулярного строения более 90 белков. В этой области биохимия незаметно переходит в родственную науку, молекулярную биологию. [c.318]

С первого же дня, проведенного в лаборатории, мне стало ясно, что в Кембридже я останусь надолго. Уехать было бы вопиющей глупостью, так как тогда я лишился бы неповторимой возможности разговаривать с Френсисом Криком. В лаборатории Макса нашелся человек, который знал, что ДНК важнее, чем белки, — это было настоящей удачей. В результате мне, к великому облегчению, уже не приходилось все свое время отдавать изучению рентгеноструктурного анализа белков. Наши беседы в обеденный перерыв вскоре сосредоточились вокруг одной темы как же все-таки соединены между собой гены. Через несколько дней после моего приезда мы уже знали, что нам следует предпринять пойти по пути Лайнуса Полинга и одержать над ним победу его же оружием. [c.35]

РИС. 13-1. Участок шкалы электромагнитных волн. Буквы Ф, С, 3, Ж, О н К над областью, соответствующей видимому свету, обозначают различные цвета. Отметка СиКа отвечает длине волны рентгеновских лучей, широко используемых в рентгеноструктурном анализе белков и других органических материалов. [c.6]

При рентгеноструктурном анализе белка неизвестной структуры регистрируется интерференционная картина от кристалла белка. Исходя из положения, числа и интенсивности рефлексов (максимумов интерференции) при определенных условиях, можно установить структуру рассеивающего кристалла [159, 160]. Вычисление распределения электронных плотностей осуществляется по формуле [c.383]

Влияние, которое оказали результаты рентгеноструктурного анализа белков на изучение их фракций, детально рассматривается в следующем томе настоящего издания. Здесь хотелось бы обратить внимание на то, что наличие уже в течение нескольких десятилетий уникальной структурной информации все еще не привело к концептуальному развитию или переосмыслению представлений о природе и принципах функционирования белков, сложившихся до становления кристаллографии макромолекул. Ставшие доступными данные рентгеноструктурного анализа о пространственном строении белковых молекул не вызвали качественных изменений в понимании биокатализа, гормон-рецепторных взаимодействий и многих других явлений. Функционирование биосистем молекулярного уровня не обрело строгой трактовки в рамках сформулированных ранее концепций ферментативных и иных реакций, равно как и последние не получили на основе структурных данных своей объективной оценки. По-прежнему, фундаментальные различия между обычными химическими реакциями в растворе и реакциями, осуществляемыми ферментами, продолжают видеться в напряжении и деформации субстрата при его сорбции в активном центре в сторону переходного состояния, в индуцированном соответствии и принудительных конформационных изменениях фермента, в его изна- [c.75]

В рассмотренной конформационной теории белка не постулируется образование в процессе структурной самоорганизации вторичных, регулярных структур. а-Спирали и р-складчатые листы должны автоматически появляться по ходу расчета на тех участках последовательности, где они оказываются самыми предпочтительными по энергии. Не привлекаются также данные рентгеноструктурного анализа белков и результаты их статистической обработки. Физическая теория и соответствующий расчетный метод исходят только из отмеченных выше четырех принципов, знания аминокислотной последовательности и валентной схемы белковой молекулы. Таким образом, в отношении пространственного строения белка теория является априорной. Предсказание трехмерной структуры строится на количественной оценке взаимодействий между всеми валентно-несвязанными атомами. При этом, однако, не требуется делать специальных предположений о роли в пространственной организации белковой молекулы водородных связей, ионных пар, дисульфидных мостиков и других видов взаимодействий. Так называемые гидрофобные [c.106]

Самым интересным фактом является совпадение найденной априорно для свободного участка Phe -Tyr конформации с геометрией этого участка в структуре молекулы БПТИ, полученной с помощью рентгеноструктурного анализа. Расхождения между опытными и теоретическими значениями углов ф, Vj/, (I) и X не выходят за общепринятые границы экспериментальных ошибок рентгеноструктурного анализа белков высокого разрешения. [c.447]

Высоко оценивая значимость кристаллографических и иных опытных данных о белках, следует тем не менее иметь в виду их принципиальную недостаточность в решении ряда общих и многих конкретных вопросов структурной и структурно-функциональной организации. Поэтому теоретический конформационный анализ неизбежно должен стать неотъемлемой составной частью всех исследований морфологических и биологических свойств белковых молекул. Для этого необходимо, чтобы расчетный метод был бы менее трудоемким и более быстрым, чем изложенный в книге метод априорного расчета. Надежность существующего метода подтверждается хорошим совпадением результатов расчета с опытными данными. Точность рассчитанных априорно координат атомов нейротоксина II и панкреатического трипсинового ингибитора не уступает точности рентгеноструктурного анализа белков с разрешением -2,0 А. О его скоростных качествах можно судить по следующему примеру. Так, полный расчет трехмерной структуры белка, имеющего -100 аминокислотных остатков, проводится двумя-тремя сотрудниками, владеющими методом, с помощью двух современных персональных компьютеров за -4 месяца, [c.591]

Н. Г. Есипова, Рентгеноструктурный анализ белков, в сб. Молекулярная биология , т. 2 (Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР), 1973. [c.353]

Третичная и четвертичная структуры белков определяются при помощи рентгеноструктурного анализа, который впервые был проведен применительно к миоглобину и гемоглобину Дж. Кендрью и М. Перутцем в Кембридже. Значение рентгеноструктурного анализа белков трудно переоценить, так как именно этот метод дал возможность впервые получить своеобразную фотографию белковой молекулы. Для получения информативной рентгенограммы необходимо было иметь полноценный кристалл белка с включенными в него атомами тяжелых металлов, так как последние рассеивают рентгеновские лучи сильнее атомов белка и изменяют интенсивность дифрагированных лучей. Таким образом можно определить фазу дифрагированных на белковом кристалле лучей и затем электронную плотность белковой молекулы. Это впервые удалось сделать М. Перутцу в 1954 г, что явилось предпосылкой Д 1я построения приближенной модели молекулы белка, которая затем была уточнена при помощи ЭВМ. Однако первым белком, пространственная структура которого была полностью идентифицирована Дж. Кендрью, оказался миоглобин, состоящий из 153 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь, В результате было экспериментально подтверждено предположение Л. Полинга и Р. Кори о наличии в молекуле миоглобина а-спиральных участков, а также М. Перутца и Л. Брэгга о том, что они имеют цилиндрическую форму Несколько позднее М. Перутцем была расшифрована структура гемоглобина, состоящая из 574 аминокислотных остатков и содержащая около [c.43]

РАЗРЕШАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ПРИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОМ АНАЛИЗЕ БЕЛКОВ [c.17]

Однако в настоящее время часто оказывается, что, даже если допустима большая гибкость углов и длин связей, данные по электронной плотности недостаточно точны, чтобы различить стандартные и нестандартные конформации. Кроме того, поскольку даже при высоком разрешении трудно определить координаты атомов белковых молекул с точностью, превышающей 25 пм, стандартные отклонения длин связей для аминокислотных остатков полипептидной цепи, характерные для методов уточнения, составляют 10 -20 пм [61]. Таким образом, при интерпретации данных электронной плотности с точки зрения стереохимии объективная оценка точности координат, полученных методом уточнения, затруднена. Поэтому результаты рентгеноструктурного анализа белков дают гораздо меньшую количественную стереохимическую информацию относительно положения атомов по сравнению с исследованиями малых молекул, для которых на основе расчетных стандартных отклонений может быть получена строгая оценка углов и длин связей для каждого атома. [c.22]

В предыдущих разделах были кратко рассмотрены причины значительно более поверхностного описания деталей стереохимии при рентгеноструктурном анализе белков по сравнению с описанием малых низкомолекулярных соединений. Однако для успешного исследования зависимости между структурой и активностью требуется более высокая точность структурных данных. Поскольку мы стремимся к более глубокому пониманию поведения активного центра или функциональных областей этих биологических макромолекул, необходимо повысить разрешающую способность дифракционных методов. Малые изменения конфигурации аминокислотных остатков в области центра связывания металла и изменения стереохимии комплексов металла в ходе каталитического процесса должны быть тщательно изучены, в особенности при исследовании ферментов, требующих участия иона металла. Как указывалось в разд. 1.2.1, описание этих структурных изменений позволяет определить стереохимическую природу электронных перестроек, происходящих при взаимодействии молекул субстрата и фермента и ответственных за каталитическое действие. [c.24]

Высокая точность определения стереохимической структуры, достигнутая в этом исследовании, очевидно, может быть получена и при структурном анализе других белков, так что подобные методы уточнения структуры следует разрабатывать и далее. Успешное применение способа уточнения структуры белка в совокупности с разностным методом Фурье приведет в дальнейшем к более совершенным методам определения стереохимических свойств координационных центров металлопротеинов и металлоферментов. Можно предположить, что результаты таких исследований окажутся весьма полезными при изучении структуры и типов связи в металлосодержащих центрах и взаимосвязи между структурой и активностью. Поэтому полезно рассмотреть результаты рентгеноструктурного анализа белков, изученных при высоком разрешении стандартными методами, и выяснить, в какой степени эти результаты способствуют пониманию их биологической функции. Тщательный анализ результатов рентгеновских исследований биологических макромолекул и применение новейших методов уточнения структуры лет через десять позволит получить более точные величины стереохимических параметров. Только тогда можно будет полностью оценить значение таких данных по сравнению с результатами других химических и физических исследований. [c.27]

В этом обзоре мы подчеркнули большую роль точных стереохимических данных для определения структурных основ функции и реакционной способности иона металла в белках и ферментах. Была обсуждена разрешающая способность рентгеноструктурного анализа белков и указаны пределы точности, достигнутые к настоящему времени при изучении структуры белков, в сравнении с результатами рентгеноструктурного анализа малых молекул. Обсуждены возможные пути уточнения стереохимических деталей структуры белков, особенно в области координационного центра металл — лиганды. [c.123]

Третичная структура белков. Рентгеноструктурный анализ белков [c.115]

Таким образом, рентгеноструктурный анализ — единственный из методов, одновременно определяющих первичную, вторичную и третичную структуру белка. Мы рассмотрим в самых общих чертах принципы рентгеноструктурного анализа белков. При [c.89]

Но исследования фибриллярных белков могли дать только самые общие сведения об укладке полипептидных цепей. Кроме того, сопоставление данных рентгеноструктурного анализа белков с данными о длинах связей и валентных углах, полученными при исследовании более простых соединений, не проводилось Астбери достаточно широко. В результате этого первая структура а-кератина была подвергнута критике [353] и сам автор отказался от нее. [c.140]

Таким образом, разобщенность двух направлений исследований структуры белков была преодолена в результате совместных усилий химиков-органиков и специалистов по рентгеноструктурному анализу белков. [c.152]

Рентгеноструктурный анализ высокого разрешения — это единственный метод, даюш,ий одновременно все необходимые сведения о первичной, вторичной и третичной структуре белков в кристалле. Успехи этого метода и определили современное положение дел в изучении особенностей пространственного строения белковых молекул. Этот параграф посвящен результатам рентгеноструктурного анализа ферментов и родственных им транспортных белков. Рентгеноструктурный анализ белков очень трудоемок, и исследование каждого объекта является итогом многолетних работ, однако и сами белки — апериодические микрокристаллы — относятся к наиболее сложным макромолекулам. Поэтому в ряде случаев оказалось, что рентгеноструктурный анализ дает необходимые сведения все-таки быстрее и в гораздо большем объеме, чем любые другие из применявшихся до сих пор методов изучения белковых молекул. [c.96]

Первый объект рентгеноструктурного анализа белков — гемоглобин — имеет более сложное строение, чем миоглобин. Его глобула образована из четырех субъединиц, не связанных между собой ковалентно, но достаточно прочно соединяемых гидрофобными связями. По две из этих субъединиц одинаковы. Соответствующие им полипептидные цепи называются а- и р-цепями. По химическому составу и пространственному строению каждая из них очень напоминает глобулу миоглобина, хотя и отличается от последней числом аминокислотных остатков. Вместе с тем в отношении связывания кислорода гемоглобин существенно отличается от миоглобина. Однако рассмотрим сначала структурные данные. [c.101]

Одним из наиболее исследованных семейств ферментов являются сери-нопротеазы. Все они предназначены для расщепления полипептидньгх цепей белков по механизму, в котором участвует боковая цепь аминокислоты серина (— Hj—ОН), находящейся в активном центре фермента. Три такие протеазы (трипсин, эластаза и химотрипсин) синтезируются в поджелудочной железе и вьщеляются ею в кишечник, где они превращают содержащиеся в пище белки в аминокислоты, способные всасываться через стенки кишечника. Благодаря возможности легко изолировать эти ферменты и их сравнительно высокой устойчивости их удалось интенсивно исследовать химическими способами еще до того, как стало возможным проведение рентгеноструктурного анализа белков. В настоящее время биохимический и рентгеноструктурный анализы позволили установить достаточно ясную картину функции этих ферментов, иллюстрирующую два аспекта действия любых ферментов каталитический механизм и специфичность к субстрату. [c.318]

RYSALIS [64] Интерпретация трехмерного распределения электронной плотности при рентгеноструктурном анализе белков [c.373]

Наиболее полно и совершенно все перечисленные факторы, обеспечивающие воздействие катализатора на субстраты, используются в биологических катализаторах — ферментах. В настоящее время в ре- ультате успен]пого развития рентгеноструктурного анализа белков установлена просгранственпая структура пееколькпх ферментов и из-веста детальная структура комплекса фермент — субстрат. В качестве примера па рис. 72 приведена схема взаимодействия фермента кар-боксипептидазы с субстратом. [c.260]

Таким образом, ближайшие перспективы экспериментального изучения пространственного строения белков, если судить по наметившейся тенденции, будут определяться достижениями в использовании синхротронной радиации. Существенных результатов можно ожидать от совместного применения рентгеноструктурного анализа белков с методами малоуглового рассеяния, криомикроскопии и многочисленными методами молекулярной спектроскопии. Среди последних ценен метод ЯМР, быстро прогрессирующий в последнее десятилетие. Его применение на гетероатомах и использование трехмерной спектроскопии ЯМР привело к упрощению анализа спектров и повышению его информативности в исследовании сложных структур. [c.75]

М. Левитт и С. Лифсон [15], а также Дж. Дайзенхофер и У. Стей-геманн [16] проанализировали данные рентгеноструктурного анализа белков и пришли к выводу о не вполне плоском строении пептидных групп, заключающемся в отклонении двугранного угла (о от 180°, пира-мидализации связей атома N и, в меньшей степени, связей карбонильного углерода. Учитывая, однако, разрешающую способность метода, речь не может идти о твердо установленных фактах, а лишь о возможных отклонениях от плоского строения группы и соответствующих инверсиях конфигураций. Теоретические расчеты энергии неплоских деформаций пептидной группы [17] показывают, что поворот вокруг связи N-0 вблизи ш = 180° на 10°и выход связи Ы-С из плоскости СМС на 20° увеличивают энергию на 2,0-3,0 ккал/моль. Более значительными энергетическими потерями сопровождается пирамидализация связей карбонильного углерода выход этого атома из плоскости С ОМ на 0,1 А требует затраты энергии около 5,0 ккал/моль. [c.136]

В табл. IV.4 приведены теоретические значения двуфанных углов ф, vjr, со и X в глобальной конформации свободного нонапептида Arg -Pro и экспериментальные значения этих углов, полученные с помощью рентгеноструктурного анализа. Сравнение теоретической и экспериментальной кристаллической структуры указывает на их полное совпадение по шейпу и форме основной цепи. Более того, имеется удовлетворительное количественное соответствие между теоретическими и опытными значениями подавляющего большинства конформационных параметров расхождение, как правило, не выходит за общепринятые границы экспериментальных ошибок при рентгеноструктурном анализе белков. Трудно предположить, что совпадение случайно. Из более чем 10 возможных конформационных вариантов нонапептида (произведение исходных низко-энергетических конформаций всех монопептидов) на завершающем этапе [c.432]

Решающим доказательством справедливости предложенного подхода к решению задачи о структурной организации белка явились результаты априорного расчета трехмерной структуры бычьего панкреатического трипсинового ингибитора и количественное представление свертывания белковой цепи как самопроизвольного, быстрого и безошибочного процесса. Рассчитанная при использовании аминокислотной последовательности и стандартной валентной схемы конформация белка совпала с кристаллической структурой молекулы БПТИ. Точность расчета значений всех двугранных углов вращения ф, у, (О и %, расстояний между атомами С всех остатков и длин реализуемых водородных связей оказалась близкой точности рентгеноструктурного анализа белков высокого разрешения. На основе данных о конформационных возможностях аминокислотной последовательности БПТИ получили свое объяснение все детали ренатурации белка, механизм которой был изучен экспериментально. Тем самым, во-первых, была подтверждена неравновесная термодинамическая модель сборки белка. Во-вторых, была апробирована физическая теория структурной организации белка, вскрывающая природу бифуркационных флуктуаций и утверждающая представление о нативной конформации белковой молекулы как о глобальной по внутренней энергии структуре, плотнейшим образом упакованной и согласованной в отношении всех своих внутриостаточных и межостаточных невалентных взаимодействий. Именно гармония между ближними, средними и дальними взаимодействиями ответственна за резкую энергетическую дифференциацию и выделение из множества возможных структурных вариантов стабильной и уникальной для данной аминокислотной последовательности конформации белка. В-третьих, продемонстрированы реальность фрагментарного метода теоретического конформационного анализа пептидов и белков и удовлетворительное количественное описание с его помощью их пространственных структур применительно к условиям полярной среды. Под- [c.589]

Для определения вторичной структуры белков используются в основном оптические методы. Конечно, более надежным является рентгеноструктурный метод, однако его применение сопряжено с определенными трудностями и требует значительного времени. Такие оптические методы, как дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм, являются более простыми и, что весьма важно, позволяют определять изменений вторичной структуры белка в растворах. При помощи дисперсии оптического вращения можно получить информацию о степени спирализации белковой макромолекулы. Несмотря на то что метод является приближенным, достаточно отчетливо просматриваются переходы типа спираль—клубок. Что касается метода кругового дихроизма, то его спектр определяется набором углов ф и у, свойственных тому или иному типу вторичной структуры. Оба метода можно расценивать как скриннинго-вые, и для полной идентификации вторичной структуры их надо комбинировать с рентгеноструктурным анализом белков. [c.43]

В части 1 книги, посвященной структурным и электронным аспектам исследования роли ионов металлов в белках, сначала речь идет о возможностях и разрешающей способности рентгеноструктурного анализа белков. Здесь обсуждаются интересные и для неоргаников, и для биохимиков проблемы установления кристаллической структуры макромолекулярных веществ. При рассмотрении каждого примера сделана попытка соотнести кристаллографические данные с результатами, полученными такими методами, как измерение магнитной восприимчивости, электронный парамагнитный резонанс, поляризационная спектроскопия монокристаллов. В этой части рассматриваются гемовые белки, цинксодержащие металлоферменты, а также кобальт-, медь-, кадмий-, ртуть-, никель-, и марганецзамещенные карбоксипептидазы. Приведены данные по белкам, связывающим кальций. [c.9]

Вовсе не очевидно, что в будущем при исследовании дифракции кристаллических белков удастся достигнуть значительного улучшения разрешения структуры. Кристаллы белков отличаются от кристаллов малых молекул высоким содержанием растворителя (>40%) в элементарной ячейке [63, 64]. Следовательно, белковые молекулы в кристаллическом состоянии не подвержены силам меж-молекулярного взаимодействия, сравнимым с силами решетки, удерживающими малые молекулы в гораздо более жестком состоянии. В связи с этим результаты рентгеноструктурного анализа белков часто основываются на участках карты электронной плотности с плохим качеством изображения. Классическим примером этого явления служит подвижность концевых областей а и Р субъединиц метгемоглобина лошади [16]. Высокие концентрации соли, используемые при кристаллизации, препятствуют образованию стабилизирующих полярных контактов между этими областями. Кроме того, нельзя не принимать в расчет роль гибкости полипептидной цепи белка, которая может оказаться существенной для ферментативной функции. Подобные факторы, относящиеся к описанию упорядоченной структуры растворителя и взамодействию молекул растворителя с белковыми остатками, препятствуют получению данных, необходимых для точного описания структуры молекулы. Очевидно, что к областям полипептидной цепи белковых молекул, которые на карте Фурье плохо различимы, методы уточнения не применимы. [c.22]

При анализе белковых структур, особенно для белков, требующих иона металла, возникают и другие факторы, осложняющие исследование. Хорошо известно, что при рентгеноструктурном анализе белков ошибки, связанные с различными стадиями структурного анализа, например с определением фазы, уточнением положения тяжелых атомов и т. д., могут приводить к искажению дифракционной картины в областях отрицательной электронной плотности расчетной карты Фурье в центрах нахождения атомов тяжелых металлов. Это явление было отмечено в ранних работах по исследованию структуры метмиоглобина кашалота [65]. Такие искажения картины электронной плотности могут значительно усложнить структурную интерпретацию этих областей. Действительно, Ба-насзак и др. [66] отмечали, что области отрицательной электронной плотности на карте Фурье метмиоглобина кашалота могут затруднить интерпретацию структурных свойств лигандов, координируемых в определенных условиях с ионами цинка и меди. Центры связывания тяжелых металлов в замещенных производных в этом случае близки к центрам связывания обоих этих ионов. Сходная ситуация может возникать для ферментов, активируемых металлом, при связывании каталитически активных металлов. [c.23]

Так как невозможно изложить метод рентгеноструктурного анализа белков вполне элементарно, не пользуясь законами дифракции и рядами Фурье, то читателям, не знакомым с этим предметом, мы рекомендуем обратиться к учебникам Китайгородского и Пинеса. [c.88]

Главное, что было разработано нового Кэмбриджской школой (Брэгг, Перуц, Кэндрю и др.) для рентгеноструктурного анализа белков — это экспериментальный метод преодоления основного затруднения, метод измерения фаз в интерферепционных максимумах. Для того чтобы изложить физическую идею, заложенную в этом методе, мы сделаем небольшое отступление. [c.96]

Возвращаясь к рентгеноструктурному анализу белков, рассмотрим исследование миоглобина, отметив несколько последовательных этапов, проделанных в этой работе. Разрешающая способность метода рентгепоструктурного анализа находится в известной мере во власти исследователя. В начале было решено ограничиться более грубой картиной, пренебрегая мелкими деталями. Было принято, что анализ ведется с разрешением в 6 А. Это означает, что интерференпии, соответствующие расстояниям в прямой решетке меньше 6 А, пе принимаются во внимание. Следовательно, в обратном пространстве выбрасываются все пятна, расстояния которых от центра больше определенного. Иначе говоря, выбор разрешающей силы приводит к тому, что мы отбираем дифракционные максимумы, достаточно близкие к центральному пятну, п тем ограничиваем используемый экспериментальный Л1атериал. Так, для получения пространственной модели миоглобина с разрешающей силой в 6 А оказалось необходимым использовать 400 дифракционных пятен. При переходе к разрешающей силе в 2 А объем обратного пространства, который приходится использовать для анализа, возрастает, очевидно, в 3 =27 раз. Отсюда число дифракционных пятен, использованных для расчетов, составило 10 ООО. При последнем повышении разрешения до 1,5 А объем обратного пространства [c.106]