Карбоксипептидаза формы

Рис. 87. Необычный ход прямой, приводящий к отрицательным значениям кинетических параметров гидролиза бромацетил-ВЬ-фенил-лактата, катализируемого карбоксипептидазой, полученный при обработке полной кинетической кривой с помощью интегральной формы уравнения скорости

Неспособность карбоксипептидазы переваривать белок еще не указывает на отсутствие С-концевого остатка. Подобная устойчивость к действию карбоксипептидазы может быть обусловлена структурой белка. В этом случае необходима предварительная денатурация белка [39]. Устойчивыми являются также С-концевые амидные остатки и /)-формы любых аминокислот. Так же, как и в случае лейцинаминопептидазы, для получения однозначных результатов белок должен быть высокой степени чистоты, а карбоксипептидаза свободна от примеси эндопептидаз. Эндопептидазы могут быть инактивированы добавлением диизопропил-фторфосфата, который не влияет на активность карбоксипептидазы [62, 144]. [c.406]

Судьба пищеварительных ферментов. При переваривании богатой белками пищи из поджелудочной железы в желудочно-кишечный тракт выделяется большое количество трипсина, химотрипсина и карбоксипептидазы. Хотя преждевременное высвобождение этих ферментов в активной форме в самой поджелудочной железе может вызвать ее тяжелое повреждение, однако эпителиальные клетки тонкого кишечника не страдают в процессе переваривания богатой белками пищи от действия [c.776]

Оптимум pH карбоксипептидазы в значительной степени зависит от природы того С-концевого остатка, на который карбоксипептидаза воздействует согласно литературным данным значение оптимального pH. может колебаться от 5,5 до 9,2. Оказалось даже возможным, используя эту способность фермента оказывать различное действие при разных значениях pH, получать модифицированные белки. Дэви и др. [4] после действия фермента при pH 7,6 удалось выделить в кристаллической форме производное Р-лактоглобулина, у которого были удалены оба С-концевых остатка изолейцина. Далее воздействием карбоксипептидазы при pH 9,2 получили другое кристаллическое производное, у которого были удалены оба концевых остатка гистидина. [c.187]

Из рассмотрения формул субстратов, на которые действуют трипсин и карбоксипептидаза (см. выше), очевидно, что действие этих ферментов зависит главным образом от стереохимической конфигурации молекулярных групп субстрата, от их формы и от их взаимного расположения. Химическая природа расщепляемых связей имеет, повидимому, второстепенное значение. Эта точка зрения хорошо согласуется с утверждением, что соединение фермента с субстратом происходит посредством связей, возникающих между их поверхностями, форма которых соответствует друг другу. [c.280]

Распределение остатков внутри и снаружи молекулы согласуется с данными для других глобулярных белков. Гидрофобные остатки предпочтительнее располагаются внутри молекулы, а заряженные группы — снаружи [52]. Поскольку участок в р-форме находится главным образом внутри глобулы, в нем обнаружено много гидрофобных аминокислот, в том числе лейцина и фенилаланина. Всего в контакте с водой не принимают участия 78 остатков. Из них 22 могут образовывать водородную связь с атомами пептидной связи или близлежащих остатков, и, по-видимому, эта возможность почти во всех случаях реализуется [3, 52]. Два остатка триптофана (63 и 147) и один остаток тирозина (238) спрятаны внутри молекулы КПА. Остальные остатки этих аминокислот находятся в частичном контакте с растворителем. Существование водородной связи между ОН-группой Туг-238 и карбонильной группой Glu-270, вероятно, имеет некоторое значение для конформационного изменения с участием Glu-270 при связывании субстрата, как описано ниже. Четыре из десяти остатков пролина расположены у N-концов спиральных участков, а три —у концов наиболее длинных цепей в слое с р-структурой. Во внутренней части молекулы находятся три карбоксильные группы, принадлежащие остаткам 104, 108 и 292. Конечно, справедливость этого утверждения зависит от того, насколько правильно установлен тот факт, что они являются свободными и не участвуют в образовании амидных связей. Карбоксильная группа Glu-292 образует солевой мостик с Arg-272, так что ее заряд локально нейтрализован. Детальное изучение карт электронной плотности обнаружило неизвестный ранее факт внедрения в молекулу карбоксипептидазы десяти молекул воды [52]. [c.514]

Электронный спектр Со2+-фосфатазы обнаруживает некоторую асимметрию в координационном окружении иона кобальта. Присоединение фосфата или арсената сильно влияет на спектр,однако форма полос и их расщепление остаются почти неизменными. Из этого можно заключить, что в целом координационная геометрия сохраняется и что фосфат или арсенат просто замещают лиганд атома металла. Самым удобным для замещения лигандом могла бы быть вода. Это предположение также напрашивается из данных по кристаллической структуре карбоксипептидазы, [c.641]

Карбоксипептидаза содержится в поджелудочной железе высших животных. Выделена она в кристаллической форме. Это белок, нерастворимый в воде при pH от 4,0 до 7,5. Активизируется трипсином. [c.344]

Для идентификации спиральных участков в развернутой цепи и их последующей укладки в окончательную структуру Лим и соавторы сформулировали ряд стереохимических правил, выведенных из качественного рассмотрения атомных моделей и интуитивных соображений. На основе таких правил предсказаны пространственные формы полипептидных цепей четырех белков, трехмерные структуры которых известны. Приведем сопоставление экспериментальных и теоретических данных, касающихся содержания регулярных структур в карбоксипептидазе. В белке содержится 113 спиральных остатков, из которых правильно предсказаны 75 при 40 ошибках в -структуры входят 45 остатков, правильно определены 42, неправильно — 21 конформационные состояния остальных остатков не идентифицированы. Подобная точность предсказания имеет место и в других случаях. [c.263]

Очевидно, что реакция идет через енольную форму кетона. Скорость этой реакции довольно низка (й =3,7.10 с ). Однако оценка каталитического эффекта карбоксипептидазы А в этой реакции показывает, что фермент ускоряет ее в Ю -Ю раз по сравнению с модельной реакцией енолизации ацетона в присутствии уксусной кислоты. [c.204]

Лондонские ученые, разработавшие первый вариант АДЕПТа, присоединили к адресу фермент карбоксипептидазу С. В качестве адреса использовали антитело против специфического антигена конкретной опухоли. Сама по себе такая молекулярная конструкция (антитело — фермент), хотя и присоединяется избирательно к поверхности опухолевых клеток, не влияет на их жизнеспособность. Но затем в организм вводят цитотоксическое лекарство в не- активной форме. Оно циркулирует в организме, не оказывая эффекта на здоровые клетки. У поверхности опухолевых клеток это лекарство под влиянием карбоксипептидазы теряет карбоксильную группу, превращается в активную форму, проникает внутрь опухолевых клеток и убивает их. [c.135]

Рис. 102. Анализ кинетических данных гидролиза бромацетил-Ь, 1-фениляактата, катализируемому карбоксипептидазой [24], с помощью интегральной формы уравнения скорости (6.135)

Хотя выдвинутая Фишером гипотеза ключа и замка оказалась весьма плодотворной и объясняет многие общие закономерности субстратной специфичности, по мере накопления в последние годы детальной информации о взаимодействиях типа фермент-молекула ее недостатки становились все более очевидными. В буквальном смысле эта теория подразумевает наличие жесткого центра связывания. В то же время имеется большое число данных, как рентгеноструктурных, так и прямых спектрофотометрических и кинетических исследований ферментов в растворе, о конформационной мобильности белков. Мы видели, что тирозин-248 карбоксипептидазы при связывании глицилтирозина сдвигается не менее чем на 1,2 нм, явно меняя природу и форму как участка связывания, так и каталитического центра (см. разд. 24.1.3.4). Это, возможно, крайний случай, однако при наличии рентгеноструктурчых [c.515]

Три другие важные эндопептидазы трипсин, химотрипсин и эластаза, а также одна экзопептидаза-карбоксипептидаза, участвующие в дальнейшем после действия пепсина в переваривании белков, синтезируются в поджелудочной железе. Все они вырабатываются в неактивной форме, в виде проферментов, и их превращение в активные ферменты происходит в тонкой кишке, куда они поступают с панкреатическим соком. [c.420]

Полоса поглощения 360 нм (s=2790 М- см ) неионизован-ной формы N-ацетил-З-нитротирозина смещается в слабо кислой среде в область 427 нм (е = 4100 М см" ), становясь при ионизации более интенсивной (рК = 7,0) изобестическая точка находится при 381 нм (б = 2200 М см" ). При обработке карбоксипептидазы 64-кратным молярным избытком ТНМ нитруются 6,7—7,1 из 19 остатков тирозина. Однако при 4-кратном молярном избытке нитрование идет лишь по одному остатку, при этом пептидазная активность снижается до 10%, а эстеразная возрастает до 170% [49]. При действии ТНМ в присутствии р-фенил-пропионата, ингибитора карбоксипептидазы, ферментативная активность не изменяется. На основании этого было сделано предположение об участии остатка тирозина в работе активного центра. [c.354]

Кроме того, вследствие мутаций в каждой из цепей гемоглобина возможна замена по крайней мере одной аминокислоты. В настоящее время известно около 100 таких мутантов [94, 170]. Изменения в составе гемоглобина можно произвести и искусственно (см. работу 18]) различными способами 1) путем образования гибридов с использованием а- и -цепей из гемоглобйнов различных видов 2) в результате протеолитического переваривания С-концевых остатков под действием карбоксипептидазы и 3) химическим модифицированием, например, сульфгидрильных групп цистеиновых остатков. Можно, разумеется, изменять валентность железа, а также природу шестого лиганда в координационной сфере железа, и даже удается получить гемоглобины, в которых состояние железа в каждой из цепей различно, например, путем смешивания растворов N- и 02. Из многих гемоглобйнов и миоглобинов удается удалить без денатурации белка железопорфириновый комплекс, а затем реконструировать полный белок из белка и порфиринового комплекса, взятых из различных источников, или вместо железопорфиринового комплекса взять при этом порфириновый комплекс другого металла (разд. 7.1 и 7.4). Исследование мутантных форм и химически модифицированных гемоглобйнов существенно расширило наши знания о природе реакций гемоглобина, и в последующих разделах мы часто будем использовать результаты, полученные с помощью мутантных и модифицированных белков. [c.148]

Карбоксипептидаза А состоит из белковой цепи, содержащей 307 аминокислот, и одного иона Zn2+ относительная молекулярная масса равна 34 600. Молекула в первом приближении имеет форму эллипсоида с размерами 5000X3800 пм. С одной стороны эллипса имеется канал, подводящий к активному центру с атомом цинка (II). Координация у металла приблизительно тетраэдрическая два атома азота и атом кислорода от трех [c.585]

По Фолку и Глэднеру, содержащая цинк карбоксипептидаза может быть активирована ионами двухвалентного кобальта в условиях, когда не происходит вытеснения одного металла другим. Допускается, что молекулы фермента находятся в растворе в двух разных конформационных состояниях. Одно из них неактивно, и ионы кобальта превращают эту неактивную форму в активную. [c.129]

Группы могут быть тетрагональными свободные места занимают молекулы воды. Структура очень многих комплексов металлов с аминокислотами и короткими пептидами рассматривается в в обзоре Фримена [37]. Активность некоторых ферментов проявляется только при комплексообразовании с ионами металлов. Наиболее изученным из них является карбоксипептидаза, структура которой определена в результате рентгеноструктурного анализа кристаллов этого белка [38, 39]. Биологически активная форма фермента содержит один атом Zп , но активность сохраняется и ири замещении на Со +. Ион Zn . имеет [c.275]

Самым доступным источником ЛАП служат почки свиньи [172]. Молекулярная масса этого фермента больше молекулярной массы карбоксипептидазы и составляет 200 000 [172, 173]. Описан также препарат из хрусталика быка [174, 175]. Детальное изучение ЛАП затруднено неустойчивостью фермента при выделении, присутствием сопутствующих эндопептидаз [17 , 177] и существоваштем множественных молекулярных форм [173, 178]. Ионы Мп + и Mg + стабилизируют и активируют белок, вследствие чего выделение обычно проводят в присутствии одного из этих металлов, чаще всего Mg2+. Зависимость степени активации ЛАП от концентрации Мп2+ [170] хорошо описывается кривой связывания при п=1 (число катионов на молекулу) и /Са=3,3-10 М . На основании этих данных и ингибирующего действия цитрата и ЭДТА ЛАП была недавно отнесена к Mg (Мп)-активируемым или Mg (Мп)-содержащим металлоферментам, хотя данные о наличии в ней этих металлов отсутствуют. [c.555]

Очищенный фермент содержит прочно связанные ионы цинка и похож в этом отношении на два других гидролитических фермента—карбоксипептидазу (гл. 15) и карбоангидразу (гл. 16). Молекулярная масса нативной фосфатазы равна 80000 [38—40]. В кислом растворе молекула белка диссоциирует на две идентичные субъединицы [40—43]. При высокой концентрации цинка образуется тетрамерная форма, причем положение равновесия димер тетрамер зависит от pH [44]. [c.636]

Пептоны и нераспавшиеся белки из желудка поступают в кишечник. В тонком отделе его гидролиз белков и пептидов происходит при участии ферментов панкреатического и кишечного соков. В соке поджелудочной железы содержатся трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы, аминопептидазы. Последовательное действие этих ферментов обеспечивает полный распад белков и пептидов с образованием смеси аминокислот. Трипсин, подобно пепсину, вырабатывается поджелудочной железой в неактивном состоянии — в форме трипсиногена, который при участии гормона слизистой энтерокиназы переходит в активный трипсин. Трипсин гидролизует пептидные связи, образованные карбоксилами лизина и аргинина. В отличие от пепсина этот фермент переваривает гистоны и протамины. Понятно, что белковая молекула под влиянием трипсина распадается на несколько пептидов, как и при действии пепсина, но в этом случае возникают пептиды иного состава. [c.119]

Карбоксипептидазы гидролизуют пептидную связь, образованную С-концевым аминокислотным остатком. Существует две разновидности карбоксипептидаз карбоксипептидаза А и карбоксипептидаза В. Карбоксипептидаза А первоначально выделяется в виде прокарбоксипепти-дазы А, которая активируется трипсином. Карбоксипептидаза А отщепляет от пептида преимущественно С-концевые аминокислотные остатки с ароматическими боковыми цепями (механизм каталитического действия карбоксипептидазы А описан в главе 2). Карбоксипептидаза В также выделяется в неактивной форме затем, будучи активированной, она атакует С-концевые остатки, содержащие только аргинин и лизин. [c.377]

Насколько геометрические параметры реальных конформационных состояний полипептидной цепи отличаются от параметров так называемых вторичных структур, можно судить по рис. П.З, на котором показано распределение на конформационных картах ф—ф остатков некоторых сегментов цепей а-химотрипсина, карбоксипептидазы А и лизоцима [61]. Во всех исследованиях, посвященных поиску эмпирических корреляций, эти сегменты отнесены к а-спиральным или -структурным. Из рис. П.З видно, что в экспериментально наблюдаемых конформационных состояниях остатков, включенных при статистической обработке во вторичные структуры, значения двухгранных углов ф, ф не только не выражаются в точки ( фц, фц) и ( фр, фр), что должно иметь место при строгой регулярности структур, а обнаруживают существенный разброс в пределах а- и -областей. Более того, в ряде случаев значения ф, ф остатков а- и -сегментов вообще находятся в совершенно других местах конформационной карты. Если ограничить отклонения а-спиральных углов ф, ф от стандартных значений, например 15°, то в трех приведенных примерах в а-спиральных сегментах окажется не 41 остаток, а лишь 18 что же касается -структуры, то при таком ограничении углов ф, ф в нее не попадет больше двух остатков. Если же исключить из структур, считающихся вторичными, по три остатка с их N- и С-концов, которые, как правило, имеют большие отклонения по углам ф, ф или отвечают другим конформационным состояниям, то содержание в глобулярных белках участков, действительно близких к регулярным, уменьшится по сравнению с принятыми в литературе в 2—3 раза. При введении количественного критерия регулярности нельзя уже будет считать вторичными структурами большинство коротких а-спиралей и -структур, в том числе и большинство спиралей из 4—9 остатков, которые являются самыми распространенными в белках. В связи с тем, что в реальных белках вторичные структуры не обладают правильными регулярными формами, их идентификация субъективна и существенно отличается у разных авторов. Например, в лизоциме Чоу и Фасман [99] к а-спиралям и -структурам относят соответственно 54 и 21 остаток, а Бэржес и соавт. [101] — 46 и 4 в субтилизине BPN (отнесения [101] даны в скобках) — 86 (69) и 27 (44), в папаине — 54 (50) и 30 (21). Подобных примеров можно привести очень много. [c.269]

Карбоксипептидаза, состоящая из 307 аминокислотных остатков, в вытянутой форме имеет длину 1114 А, а в свернутой — 50,0 А. Количественные исследования кристаллографических моделей белков позволили получить новые опытные данные об упаковке атомов в глобуле и атомной плотности белковых молекул. Нативное состояние белковой молекулы имеет высокий коэффициент упаковки, в среднем 75% (с вариацией от 68 до 82%, М. Клэппер [21] и Б. Ли и Ф. Рихарде [10]). Для сравнения отметим, что у правильных сферических тел этот коэффициент равен 74%, а у молекул жидкой воды и жидкого цикло-гексана составляет 58 и 44% соответственно. По плотности упаковки белки близки кристаллам малых органических молекул (70—78%), связанных между собой дисперсионными, лондоновскими силами. Из-за высокой плотности упаковки белки отличаются слабой сжимаемостью. Так, их коэффициент сжимаемости в 20 раз меньше, чем у масла, и практически совпадает с коэффициентом сжимаемости олова и каменной соли. Плотность белка неодинакова во всех частях глобулы. У. Козман и соавт. [22], например, нашли, что плотность центральной части ниже кажущейся плотности белковой молекулы в растворе. Это наблюдение, однако, имеет частный характер. Низкая плотность и даже "пустоты", т.е. области, не заполненные атомами белка, встречаются в различных частях глобулы. Как правило, в них находятся единичные молекулы воды, связанные с аминокислотными остатками водородными связями. Молекулы Н2О обнаруживаются рентгеноструктурным анализом и составляют с белком как бы единое целое. Интересно, что белки, содержащие большое число дисульфидных связей, не отличаются повышенными коэффициентами упаковки и большей плотностью. [c.345]

Причина этих различий, вероятно, в том, что использованные для ренгено-структурного анализа кристаллы карбоксипептидазы А имели необычную форму и кристаллографические характеристики [1371]. Было показано также, что конформации карбоксипептидазы В различаются в кристалле и растворе [1372]. По добное положение отмечалось и для ферментов других классов (см., например [1373]). [c.96]

Известны многочисленные данные, свидетельствующие о подвижности групп в белковых молекулах и многообразии конформационных состояний белков в целом (см. обзоры [1375-1379]. Во многих случаях изменение конформации происходит при изменении внешних условий (pH, температура и т.п.) или же при присоединении лигандов. Однако и при фиксированных условиях белки, по-видимому, существуют в нескольких или многих состояниях, взаимопревращения между которыми происходят достаточно быстро. Это следует, во-первых, из экспериментов по изотопному обмену протонов в белках, выявляющему наряду с быстрой стадией обмена также и более медленную стадию, которую относят к обмену протонов внутри глобулы, скорость которой лимитируется скоростью конформационного изменения белка [138О]. Во-вторых, такие изменения можно проследить, используя "репортерные группы , введенные в белок, и исследуя спектральные или иные физико-химические изменения, происходящие с белком. Например, в случае модифицированной карбоксипептидазы удалось обнаружить рН-не-зависимый конформационный переход с кажущейся константой скорости около Б с [1381]. Далее конформационная подвижность в белках прослеживается методами ядерного магнитного резонанса высокого разрешения [1382] по положению и форме сигналов от отдельных атомов и групп. Существует много других способов констатации конформационных изменений в белках [1383-1385], рассматривать которые здесь не представляется возможным. Единственно хотелось бы упомянуть о принципиальной возможности априорного расчета относительно небольших белковых молекул, дающего сразу сведения об энергиях большого набора состояний белка и, следовательно, о его конформационных возможностях [153,1386], а также о возможности компьютерного моделирования подвижности белков методами молекулярной динамики [1387,1388]. [c.96]

Механизм действия карбоксипептидазы изучен не столь хорошо, как для сериновых и тиоловых протеаз. Роль всех каталитических групп однозначно не установлена. Ион цинка, по всей вероятности, играет роль электрофильного катализатора, поляризуя карбонильную группу и стабилизируя образующийся на атоме кислорода отрицательный заряд (гл. 2, разд. Б.7) [118]. Характер рН-зависимости скорости реакции позволяет сделать вывод, что в каталитическом процессе участвует ионизированная карбоксильная группа 01и-270. График зависимости активности фермента от pH представляет собой колоколообразную кривую с максимумом при pH 7,5 положение максимума определяется ионизацией основной формы группы с р/Са = 6 и кислой формы группы с р/Са = 9,1 в свободном ферменте [119, 120]. Более низкий р/Са соответствует 01и-270, более высокий пока не отнесен ни к какой группе. По всей видимости, гидроксильная группа Туг-248 выступает в этой реакции в роли обшей кислоты [ПО]. Хотя прямых данных в пользу высказанного предположения нет, данный остаток, несомненно, важен для проявления пептидаз-ной активности. Модификация боковой цепи тирозина в результате ацетилирования или диазотирования подавляет пептидаз-ную активность, но усиливает эстеразную активность фермента [121]. Интересно, что при замешении цинка атомом ртути, кадмия или свинца эстеразная активность не изменяется, а пеп-тидазная подавляется [122]. [c.379]

Традиционный подход к анализу процессов ферментативного катализа, сформировавшийся на основании химических исследований задолго до определения кристаллической структуры ферментов, основывается на следуюш,их факторах общий кислотно-основный катализ катализ ионами металлов нуклеофильный катализ электростатический катализ эффекты подобия (сочетание внутримолекулярной реакции и правильной ориентации) напряжение (деформация субстрата) индуцированное соответствие (деформация фермента). Наличие всех этих факторов в настоящее время в той или иной степени установлено. Наиболее распространен общий кислотно-основный катализ [реакции, катализируемые дегидрогеназами, сериновыми протеазами (а также, по-видимому, тиоловыми протеазами и карбок-сипептидазами), рибонуклеазами, лизоцимом]. Ускорение реакций ионами металлов в его классической форме стабилизации аниона имеет место при функционировании карбоксипептидазы [c.413]

Карбоксипептидаза А, пищеварительный фермент, расщепляющий С-концевой пептид в полипептидах, служит примером фермента, в основе каталитического действия которого лежит совершенно иной механизм. Структура этого фермента и его комплекса с глицилтирозином-аналогом субстрата-раскрыта на уровне атомного разрешения. Связывание глицилтирозина вызывает большие структурные изменения в области активного центра, в результате которых эта область теряет воду и становится гидрофобной. Пример карбоксипептидазы А иллюстрирует ту важную роль, которую играет в катализе индуцированное соответствие формы фермента форме субстрата. Другая примечательная особенность данного фермента состоит в том, что в его активном центре содержится ион цинка, имеющий существенное значение для катализа. Карбонильный атом углерода расщепляемой пептидной связи поляризуется цинком и становится более чувствительным к нуклеофильной атаке. Здесь мы видим пример индукции смещения электронов в субстрате. При катализе карбоксипептидазой А молекула воды, активированная глутаматом-270, непосредственно атакует карбонильную группу расщепляемой пептидной связи одновременно тирозин-248 отдает протон на НН-группу этой связи, и в результате происходит гидролиз. [c.150]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология