Денатурация как буферы III

При выделении фермента используют метод фракционирования белков путем изменения pH. Очистка фермента на этой стадии достигается за счет денатурации белков, которые отделяют центрифугированием. Изменение pH белкового раствора следует осуществлять осторожно, по возможности не использовать сильные кислоты и щелочи. Рекомендуется добавлять уксусную кислоту, трис-буфер, карбонат натрия и др. Добавление соответствующего буфера или кислоты проводят на холоде. Их вносят по каплям, по стенке сосуда, при постоянном перемешивании. После нейтрализации раствора проводят короткую инкубацию при 25—30° С, чтобы перед центрифугированием произошла полная агрегация денатурированных белков. [c.199]

Кинетика денатурации пепсина. Условия опыта 15° С, pH 6,9 (фосфатный буфер) концентрация фермента 5 мг/мл [c.24]

Рис. 2.12. Кривая теплопоглощения при термической денатурации ДНК в 0,15 М фосфатном буфере (рН= = 10,6). Точка перегиба на кривой соответствует температуре плавления (Гпл) ДНК

Располагая колонкой с термостатируемой рубашкой и опираясь на различие прочности сорбции нативной и денатурированной ДНК на оксиапатите, можно фракционировать фрагментированную ДНК по склонности к денатурации, например по ГЦ-составу. Для этого пропускают через колонку фосфатный буфер в концентрации, способной вымывать денатурированную ДНК, заведомо не снимая нативную (напрпмер, 0,08 М), и ступенями повышают температуру [c.236]

В этом, да и во всех остальных случаях неспецифической элюции, экспериментатор пе должен упускать из по.чя зрения возможности необратимой денатурации очищаемого белка или белкового лиганда. Нередко приходится искать компромисс между эффективностью элюции и опасностью такой денатурации. По этой причине элюированный с колонки препарат следует немедленно путем диализа или гель-фильтрации перевести в подходящий буфер, а сорбент — промыть. Выяснение эффективности того или иного метода неспецифической элюции можно провести, как обычно, с помощью предварительных опытов в пробирках. Опасность необратимой денатурации следует оцепить, наблюдая динамику инактивации раствора вещества в элюенте. Эта оценка должна предшествовать выяснению эффективности элюции, если наличие вещества в элюенте выявляется по его биологической активности. [c.408]

Сывороточный альбумин лизоцим и другие белки 20— 30 мг растворяют в 1 мл раствора 0,01 М натрий-фосфатного буфера (pH 6,8) и ставят на диализ против того же буферного раствора с двухкратной сменой буфера не менее чем на 4 ч. Проводить диализ более 20 ч не рекомендуется, так как имеется опасность частичной денатурации белка. [c.115]

Существует несколько методов определения молярных процентов гуанина и цитозина (мол. % G + ) в ДНК, которые мы перечислим ниже 1) гидролиз и последующее разделение нуклеотидов или пуриновых ИЛИ пиримидиновых оснований 2) определение плавучей плотности 3) определение температуры плавления (денатурации) 4) бромирование [58] 5) апуринизация [37] 6) определение отношения Агео/Агао в буфере с низкой ионной силой при pH 3 [25] 7) жидкостная хроматография под высоким давлением нуклеотидов или свободных оснований [14,39]. Примесь РНК мешает определению всеми этими методами, за исключением методов, основанных на измерении плавучей плотности и температуры плавления Тт), поэтому последние стали наиболее популярными. [c.127]

Добавка органического модификатора к буферу Недостаток заключается в возможной денатурации белка. [c.67]

Рассмотренные выше обстоятельства приходится учитывать в процессе разделения белков и пептидов [106, 107]. При КЗЭ белков с немодифицированным капилляром рекомендуется после каждого проведенного разделения при вводе пробы из биологических матриц тщательно промывать капилляр раствором едкого натра. При этом молекулы, адсорбированные на стенках капилляра, удаляются. Если значения pH вьппе изоэлектрической точки (р/), то белки находятся в анионной форме, т.е. имеют тот же заряд, что и стенки кварцевого капилляра. Предпочтительный pH буфера составляет 9-11. При pH < 2 адсорбция белков уменьшается вследствие протонирования силанольных групп. Возникают проблемы иного рода очень малый ЭОП и возможная денатурация белков. Для предотвращения сорбции белков стенками капилляра к буферу добавляют соли щелочных металлов, низших полиаминов, цвиттер-ионов, обладающих большой буферной емкостью. Перспективно использование неионных ПАВ в качестве динамических покрытий. [c.350]

Рис. 12.7. Необратимая денатурация производных химотрипсина в 6 М мочевине, 0,1 М фосфатном буфере (pH 8) при 25 °С [45].

Эти олигонуклеотидные фрагменты разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, обладающего высокой разрешающей способностью [129, 135] (рис. 10.12). Чтобы исключить возможность образования внутримолекулярных вторичных структур (этот процесс особенно характерен для длинных олигонуклеотидов), в электродный буфер и в гель добавляют мочевину, выполняющую роль денатурирующего агента. При разработке этих систем гель-электрофореза было отмечено, что длина нуклеотидной последовательности, поддающейся прочтению непосредственно с помощью электрофореграммы, определяется разрешающей способностью метода электрофореза, которая в свою очередь зависит от толщины геля. В случае гелей толщиной 1—2 мм на радиоавтограмме обнаруживаются диффузные полосы, поскольку радиоактивный источник (фрагменты ДНК) весьма удален от поверхности рентгеновской пленки. Более тонкие гели (0,1—0,4 мм) позволяют достичь очень высокого разрешения олигонуклеотидов и обладают к тому же дополнительным преимуществом, которое заключается в том, что за счет тепла, выделяющегося в ходе электрофореза, происходит полная денатурация петель, обогащенных G -парами [129, 135]. [c.191]

Пробы растворяют в буфере для концентрирующего геля, к которому добавлены 12,5% глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-меркаптоэтанола. До электрофореза их прогревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане для того, чтобы прошла полная диссоциация и денатурация всех белков. В качестве красящей метки к пробам можно добавить бромфеноловый синий или феноловый красный. Окончательно приготовленные пробы должны содержать 1—5 мг/мл белка, причем в маленькие лунки (3X0,75 мм) достаточно вносить 5—25 мкг белка. Так как проводимость геля меняется по мере прохождения через него концентрирующего буфера, следует поддерживать постоянными напряжение или мощность, а не ток. [c.157]

При электрофоретическом разделении ферментов можно применять множество различных систем буферных растворов и гелей. Однако в некоторых случаях следует позаботиться о том, чтобы предотвратить денатурацию белков в процессе электрофореза. Так, например, нельзя использовать буферы с чрезмерно высокими или низкими значениями pH, а при исследовании термолабильных ферментов необходимо тщательно охлаждать систему. В качестве носителей при разделении ферментов обычно применяют ацетат целлюлозы или гели. Бумага для этих целей непригодна, так как она сильно адсорбирует ферменты. [c.279]

М. Ц. диссоциирует на субъединицы прп обработке его восьмпмолярным р-ром мочевпны лпбо при диализе против ацетатного буфера pH 4,0, содержащего аскорбиновую или этилепдпаминтетрауксус-ную к-ту. Выделение Ц. производят фракционированием белков сывороткп крови сульфатом аммония, осаждением спиртом в изоэлектрич. состоянии балластных белков, избирательной денатурацией белков хлороформом II спиртом и последующей экстракцией Ц. пз конечного осадка солевым р-ром (см. также Металлопротеиды). [c.411]

Поскольку значения молярного содержания ГЦ ( /о) и Тщ связаны линейно, то расчет для неизвестной ДНК производится сравнительно просто. На расчеты влияют концентрации буферных растворов, в которых проводят измерения, так как значение Тт логарифмически зависит от концентрации иона натрия в растворе. Наиболее широко применяемым при измерении значений тепловой денатурации буфером является цитратно-солевой (1-SS , 0,015 М тризамещенного цитрата натрия в 0,15 М Na l, pH 7,0). Для этого буферного раствора установлено следующее соотношение [c.144]

Денатурацию чаш е всего осуществляют кратковременным нагреванием раствора ДНК в 0,12 М Ка-фосфатном буфере до 97°, ренатурацию — охлаждением до так называемой критической температуры , которая на 20—25° ниже температуры плавления данной ДНК. Эту операцию, по аналогии с технологией обработки стали, называют отжигом . В отсутствие денатурирующих добавок температура отжига обычно близка к 60° в случае высокого содержания в ДНК ГЦ-пар она может быть заметно выше. Степень ренатурации пропорциональна произведению исходной концентрации раствора ДНК и времени отжига, которое обозначают символом ozf. Перед денатурацией ДНК необходимо тем или иным способом раздробить на фрагменты длиной 400—500 нуклеотидных пар. Без такого дробления не только сильно замедлится процесс ренатурации, но и благодаря наличию разбросанных по длине ДНК одинаковых (повторяющихся) последовательностей нуклеотидов может образоваться пространственная сетка молекул ДНК. [c.241]

Есть вариант очпстки вещества, когда опо свободно проходит через колонку, в то время как примесп на ней задерживаются. Подбор pH для этого варианта осуществляется аналогично, но выбор следует остановить на таком его значении, когда концентрация вещества в отстое только начинает уменьшаться, т. е. на лсоменте самого начала сорбции вещества на обменнике. Кстати, такой вариант очистки является наилучшим для лабильных белков — как потому, что он занимает минимальное время, так и потопу, что любой процесс сорбщш—десорбции таит в себе опасность денатурации белка. Иногда пропусканием белка без задержки последовательно через анионо-и катионообменник (при разных значениях pH буфера) удается очистить белок почти полностью. [c.291]

Определение. 0,5—1 мкмоль белка растворяют в 10—20 мл воды и осаждают на холоде, добавляя трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%- Осадок промывают 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, а затем 3—4 раза ацетоном для удаления ее следов. Указанные стадии позволяют удалить свободные аминокислоты, которые могут загрязнять препарат белка, и приводят к денатурации белка, повыщающей доступность С-концевых аминокислот к действию карбоксипептидаз. При определении С-концевых аминокислот в пептидах первые стадии необходимо опустить. Промытый осадок белка или пептид растворяют в 0,2 М аммоний-бикарбонатном буфере или в [c.155]

Принципиально должна существовать также возможность использования в КЗЭ испытанного в классическом электрофорезе и в жидкостной хроматографии анионного ПАВ ДДСН. Однако в систематических исследованиях кислых белков оказывается, что добавка ДДСН в количествах от ррт до одного процента к пробе и к буферу приводит к очень неопределенным результатам. В общем случае не улучшается ни эффективность, ни селективность, а даже наблюдается некоторое ухудшение этих характеристик. Возможным объяснением этого может быть хорошо известное действие денатурации, оказываемое ДДСН на белок. Наряду с этим, в наблюдаемой потере селективности большую роль играет, конечно, адсорбция ПАВ на биомолекулах и связанное с этим появление заряда пробы. Первоначальная структура заряда белков может полностью исчезнуть или перекрываться этим эффектом, так что разделение в электрическом поле произойдет только лишь по адсорбированным зарядам детергентов. [c.69]

Низкие концентрации ПАВ увеличивали степень спиральности топо- и парамионизина, повышали температуру тепловой денатурации на 10—15°, способствовали повышению устойчивости белков к перевариванию трипсином [152]. Подобные результаты получены в работе Витвицкого [153]. Повышение термостабиль-ности комплексов миоглобина с ПАВ обнаружено в работе [154], причем эффект сильнее выражен для ja, С14 и С , чем для g и g. Увеличение конформационной стабильности трипсина при взаимодействии с фосфолипидами показано в работе [155]. Мосолов и Афанасьев [156], инкубируя трипсин при 37 С в фосфатном буфере (pH 7,8), содержащем жирную кислоту, наблюдали при одних значениях концентрации денатурирующее действие жирных кислот, а при других — защитное действие. [c.28]

Определение цистеина всегда было трудной задачей, так как результат очень часто зависит от используемого метода. На результат оказывают влияние такие факторы, как реагент, pH, буфер, доступность SH-rpynn для реагента, а также степень денатурации. Методы определения SH- и S—S-групп — окисление, образование меркаптидов, полярография, метод вращающегося платинового электрода, потенциометрия и алкилирование — описаны в литературе [27, 73]. [c.402]

С повышением темпердтуры падает вязкость подвижной фазы, а следовательно, и гидродинамическое сопротивление столбика сорбента соответственно сокращается время достижения равновесия. Теоретически верхним пределом температуры в колонке служит та величина, при которой наступает тепловая денатурация белков. На практике приходится работать при более низкой температуре, в особенности при наличии в исследуемой смеси протеаз и других гидролаз. В ряде случаев, в частности при обработке тканевых экстрактов, рекомендуется работать при температуре близкой или ниже О °С и в буфере, содержащем несколько процентов изопропанола. В этом нет необходимости, если рн среды не совпадает с оптимальной областью действия гидролаз, или в среде присутствуют ингибиторы протеаз, или выделение ведут в присутствие денатурирующих агентов, таких, как солянокислый гуанидин или мочевина, наконец, когда исследуемый белок отделяют с помощью специфического сорбента (например, при аффинной хроматографии) [1]. [c.422]

Промытый осадок ресуспензируют в 4 л 0,01 М Na-фосфат-ного буфера pH 6,8. Смесь нагревают до начала кипения. После денатурации к осадку добавляют тот же буфер и смесь кипятят 5 минут. [c.89]

Экстракция растворимых белков из тканей может происходить только после разрушения клеточных оболочек, так как последние непроницаемы для больших белковых молекул. Разрушения клеток можно достичь механическим путем, растирая их с песком или с кизельгуром однако при этом наблюдается некоторая потеря белка за счет денатурации, вызываемой адсорбцией белка на силикате. По этой причине лучше разрушать клетки такими приборами, как мясорубка Латапи или гомогенизаторы. Структура клетки разрушается также при действии органических растворителей, например спирта, ацетона или глицерина. Если концентрация глицерина не превышает 85%, то в глицериновый экстракт переходит значительная часть растворимого белка. Этим способом можно экстрагировать гидролитические ферменты из поджелудочной железы и из других органов. Глицериновые экстракты при комнатной температуре относительно стабильны. Повидимому, рыхлая ассоциация белка с полярными гидроксильными группами глицерина уменьшает скорость его денатурации. Однако эти же полярные группы в молекуле глицерина обусловливают взаимное притяжение его молекул и высокую вязкость этого растворителя. Из глицериновых экстрактов очень трудно поэтому получить чистые препараты белков. В связи с этим глицерин в настоящее время редко применяется для разрушения клеточных оболочек. Вильштеттер и его сотрудники для разрушения клеток пользовались ацетоном. Этот метод основан на том, что многие белки при концентрации ацетона выше 80—90% денатурируются очень медленно. Для экстракции размельченный или пропущенный через мясорубку орган помещают в ацетон. Преимущество этой процедуры заключается в том, что ацетон не только разрушает клеточные оболочки, но одновременно экстрагирует из клеток и большинство липидов. Липиды можно затем удалить количественно при последующей обработке эфиром. Остаток после удаления липидов высушивается на листе фильтровальной бумаги и экстрагируется водой, разведенными растворами солей или буферов. Хотя большинство белков, в том числе много важных ферментов, можно получить из ацетоновых вытяжек в нативном состоянии, однако надо помнить, что некоторые лабильные белки при действии этого растворителя денатурируются. [c.10]

Для фермента в 0,1 М калий-фосфатном буфере при pH 7,2 с помощью осмометра было получено средиечнслеиное значение мол. веса, равное 100 000. Затем фермент подвергли денатурации и методом седиментационного равновесия определили средневесовое значение мол. веса, оказавшееся равным 33 000. Объясните, почему этот эксперимент не доказывал, что при денатурации фермент расщепляется на три субъединицы. Приведите пример возможного сочетания из четырех субъединиц, который находился бы в согласии с полученными выше результатами. [c.453]

Таким образом, 7 пл данной ДНК линейно зависит от логарифма концентрации соли или удельной электропроводности [23—25]. Следовательно, ПО величинам, полученным в каком-то определенном буфере, можно путем экстраполяции установить, каких значений можно ожидать при работе с SS или любым другим буфером, ионная сила которого находится в указанном диапазоне (при pH, близком к 7) [26]. Тепловую денатурацию ДНК с высоким содержанием ГЦ-пар можно проводить, кроме того, в буфере, в котором концентрация солей в 10 раз меньше, чем в SS (0,1XSS ) для этого образцы ДНК (которые обычно хранят в SS ) разбавляют в 10 раз дистиллированной водой. 7 пл при этом понижается на 15,4° по сравнению с исходным препаратом [15], и поэтому для таких препаратов ДНК содержание ГЦ-пар рассчитывают по формуле [c.188]

Одним из самых мягких приемов удаления белков из раствора полисахарида является метод, введенный Севагом [1]. Белки денатурируются при встряхивании с хлороформом и образуют голь, остающийся после центрифугирования на границе раздела вода — хлороформ. Чтобы облегчить денатурацию, часто вместо воды лучше использовать буфер с pH 4—5 и всегда необходимо прибавлять небольшие количества и-бутанола или к-пентанола. [c.261]

Молекулы нативной и денатурированной ДНК связываются с гидроксиапатитом при низкой концентрации фосфата (0,01 — 0,03 М натрий-фосфатный буфер, pH 6—8). При 0,12—0,14 и 0,4—0,5 М концентрации указанного буфера элюируются соответственно одно- и двухцепочечные формы ДНК [101—104]. Присутствие других однозарядных анионов, по-видимому, не имеет значения, однако добавление в элюент мочевины и (или) детергентов, например додецилсульфата натрия, приводит к увеличению выхода высокомолекулярной ДНК. Концентрация ионов фосфата, при которой с колонки с гидроксиапатитом элюируются молекулы нативной или денатурированной ДНК, не зависит от температуры. Поэтому при фракционировании на таких колонках можно использовать как процессы денатурации ДНК (т. е. разделять комплементарные цепи ДНК, денатурированной непосредственно на колонке под действием температуры или денатурирующих агентов типа формамида), так и реассоциации ДНК (образования двойной спирали из отдельных цепей ДНК). Реассоциация главным образом зависит от концентрации комплементарных цепей и, следовательно, от частоты их повторов в рассматриваемой последовательности [105]. С помощью контролируемой реассоциации ДНК генома с оли-гонуклеотидными зондами (фрагментами РНК или ДНК) и последующего разделения полученных гибридов на колонках с гидроксиапатитом можно определить число повторяющихся или уникальных последовательностей этой ДНК [105]. [c.183]

Печень измельчают ножницами в фарфоровой ступке и тщательно растирают пестиком до получения однородной массы. После этого добавляют 4 мл 0,03М фосфатного буфера. Содержимое ступки продолжают размешивать пестиком и добавляют 4 капли фтористого натрия. В две пробирки отмеривают при помощи шприца без иглы по 10 капель 0,03 М фосфатного буфера с pH 8,2, по 5 капель раствора крахмала и добавляют по 2 капли фторида натрия. В одну пробирку (контроль) добавляют 10 капель раствора ТХУ для денатурации ферментов и перемешивают. Вторую пробирку (опыт) встряхивают в течение нескольких минут для аэрации, затем пропускают через жидкость кислород в течение 5 мин, вновь встряхивают, чтобы общая продолжительность аэрации и насыщения кислородом со-, ставляла 30 мин. После эТого в опытную пробирку добавляют 10 капель раствора ТХУ и перемешивают. Содержимое контрольной и опытной пробирок переливают в центрифужные пробирки, центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в обычные пробирки, добавляют в каждую пробирку по 10 капель раствора молибденовокислого аммония и по 5 капель раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляют в пробирки по 5 мл дистиллированной воды и определяют оптическую плотность при красном светофильтре в кюветах шириной 10 мм против дистиллированной воды. [c.136]

Суспензию клеток (30 мл с содержанием сухого вещества 20—50 мг/мл) в подходящем буфере смешивают с 20 мл шариков Ballotini № 12 в соответствующем контейнере (для воздуха важно оставить не меньше 20 7о объема емкости) и в течение 0,5 мин для охлаждения контейнера через аппарат пропускают СОг. Затем в течение 3,5—5 мин в зависимости от типа клеток пробу встряхивают с частотой 3000 движений в минуту. Шарики удаляют низкоскоростным центрифугированием или пропусканием смеси через грубый стеклянный фильтр. Некоторые исследователи предпочитают использовать вместо стеклянных шариков пластмассовые, как описано Россом [9], чтобы свести к минимуму денатурацию ферментов. Если описанную выше методику применяют для выделения клеточных стенок, то пробу после встряхивания немедленно подвергают обработке, обеспечи- [c.144]

Не ранее чем за сутки готовят лизирующий буфер (4% ДСН в буфере ТЭ, pH 12,4). Важно точно измерить pH, так как при pH 12,5 происходит необратимая денатурация плазмидной ДНК. Наливают в 1,5-мл центрифужную пробирку (производятся фирмой Brinkmann Instruments номер по каталогу 22-36-911-1) 0,6 мл ли-зирующего буфера, после чего пастеровской пипеткой вносят туда же 40 мкл клеточной суспензии. Суспензию хорошо перемешивают, не прибегая к помощи специальных перемешивающих устройств и избегая сильного взбалтывания. (Чтобы лишний раз не переносить куль- [c.137]

ДНК иммобилизуют на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах, как описано в разд. 22.6.5 Предварительные процедуры . Используют автоклавирование и обработку буферов диэтилпирокарбонатом если препараты ДНК содержат примеси РНКазы, то их обрабатывают перед денатурацией диэтилпирокарбонатом илн протеолитическими ферментами. Продолговатые фильтры размером 3x9 мм или круглые с диаметром 10 мм предынкубируют в смеси Денхардта. Используют буферы, не содержащие РНКазу. [c.158]

Формамид является лучшим растворителем для снижения температур денатурации двухцепочечных комплексов ДНК и гибридов РНК — ДНК. При более низких температурах денатурации снижается степень термической деградации нуклеиновых кислот. В буферах, содержаш,их от 0,035 до 0,88 М Na I, на каждый процент формамида Тт ДНК снижается на 0,60 °С [34]. Для гибридизации рРНК на фильтре Джиллеспи и Джиллеспи [29] применяли 50%-ный формамид в буфере [c.159]

Двухцепочечную ДНК можно денатурировать любым способом. Однако если концентрация соли в ней выше, чем в буфере ТЕ, то мы рекомендуем проводить денатурацию щелочью. Если зонд повторно используется после длительной гибридизации в водном растворе, его можно денатурировать NaOH. Добавьте к зонду 1/10 объема 1,5 М NaOH и через 10 мин добавьте 1/10 объема 1,5 М НС1. Если зонд в формамиде, то можно использовать тепловую денатурацию. Зонд становится наполовину ренатурированным в соответствии с таким уравнением [c.128]

Тестируемая ДНК- Тестировать можно геномную или клонированную ДНК, амплифицированную в ПЦР, просто клонированную и неамплифицированную геномную ДНК- Получение ДНК в ПЦР описано в разд. 4. Клонированную и неамплифицированную геномную ДНК следует предварительно обработать рестриктазами для последующего количественного учета, а также для достижения максимально эффективной денатурации и реассоциации с зондом. Обработайте ДНК рестриктазами, выщепляющими тестируемый фрагмент, удалите ферменты фенольной экстракцией, сконцентрируйте ДНК, осадив ее этанолом. Ресуспендируйте в ТЕ-буфере в концентрации 100 мкг/мл. [c.147]

Помимо последовательности ДНК, которую необходимо амплифицировать, смесь для ПЦР содержит буфер, дезоксирибо-нуклеозидтрифосфаты, два праймера, специфичных в отношении связывания с исследуемым образцом, и термостабильную ДНК-полимеразу Taq. Буфер для ПЦР, использующий 7 а<7-полиме-разу, содержит 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-НС1, pH 8,4, 2,5 мМ Mg b и 100 мкг/мл желатины (Dif o). Желатина предпочтительнее БСА, так как она более устойчива к коагуляции на этапе денатурации и легко стерилизуется автоклавированием. Некоторые методики для нарушения вторичной структуры ДНК предусматривают использование 10%-ного диметилсульфоксида (ДМСО), хотя по нашему опыту это соединение в некоторой степени ингибирует полимеразу и снижает выход продукта ам-плификацрш. Если ДМСО все-таки применяется, для удобства следует приготовить 10-кратный исходный раствор и хранить его при —20°С. [c.179]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология