Метод метки предшественника

X контролируют изменение во времени концентрации и активности не только вещества X, но и следующего за ним в ходе превращений (7.63) вещества . Этот вариант получил название метода метки предшественника. Рассмотрим, каким образом в этом случае можно определить скорости образования и расходования . Обозначим концентрацию Y в системе через Y, активность — через /у, а удельную активность — через /уд. у- По аналогии с (7.64) можно записать, что [c.282]

Кинетический изотопный метод в варианте метода метки предшественника был использован, например, при изучении окисления метана в смеси СН4, [c.283]

Метод метки предшественника [c.13]

Какую информацию можно получить в каждом из вариантов кинетического изотопного метода в варианте метки исследуемого промежуточного соединения и в варианте метки предшественника [c.294]

Механизм реакции был предметом многих исследований [285]. Внутримолекулярный характер перегруппировки доказан перекрестными экспериментами с использованием метода меченых атомов (метка — С) [286]. Об этом же свидетельствует и обнаруженное сохранение конфигурации при Н [287], На первой стадии происходит отрыв кислого протона с образованием илида 72, который удалось выделить [288]. Многочисленные данные [289] о наличии спектров ХПЯ [290] (см. т. 1, разд. 5.8) свидетельствуют о том, что непосредственным предшественником продукта является свободный радикал. Был предложен механизм с участием радикальных пар [291] [c.167]

В некоторых случаях достаточно самого факта более или менее эффективного включения предшественника, меченного С или Н, в конечный продукт превращения. В более общем случае, однако, желательно или даже необходимо определить распределение метки в молекуле продукта реакции. Например, классическим доказательством поликетидной гипотезы явилось выяснение того факта, что метка из [1- С]- или [2- С] ацетата располагается в чередующихся атомах углерода [2, И]. Именно относительная трудность установления распределения метки в наибольшей степени ограничивает сферу применения радиоизотопного метода. Определение положения меченых атомов в молекуле предполагает расщепление последней с помощью химических реакций, характеризующихся гарантированной специфичностью и высоким выходом, до все более и более мелких фрагментов — в идеале до одноуглеродных молекул типа СОг или метиламина [109]. Большое значение при этом имеет чистота реагентов и продуктов деградации. Реакции, конечно, могут проводиться только последовательно, и даже самому искусному экспериментатору при самой скрупулезной работе часто необходимо значительно большее количество вещества, чем может быть получено в биосинтетическом эксперименте. [c.472]

Общий недостаток метода применения тяжелых изотопов и их масс-спектрометрического определения заключается в его невысокой чувствительности, обусловленной, главным образом, относительно большим содержанием (около 1 %) природного С. По этой причине в масс-спектре любого органического соединения с десятью атомами углерода уже содержится изотопный пик , имеющий на одну единицу массы больше, чем молекулярный ион интенсивность этого пика составляет 11 % от интенсивности [М]+. В этих условиях присутствие 2 % меченого соединения с одним атомом или С, увеличивающее интенсивность пика иона [М+1]+ до 13%, заметить практически невозможно. Положение облегчается при введении нескольких меченых атомов в том же самом спектре природная интенсивность пика иона [М + 2] + составит только 1 % от интенсивности пика [М]+, так что добавление 2 % метки 2Н2 или можно обнаружить без труда. Однако и в этом случае точность определения невелика. Если такая точность удовлетворяет требованиям эксперимента, то масс-спектрометрия может служить очень удобным методом исследования. Таким образом, этот метод имеет хотя и ограниченные, но очень полезные сферы применения. Например, чувствительности метода масс-спектрометрии достаточно, чтобы вполне надежно определить число введенных в соединение меченых атомов, если полностью меченный в одном или нескольких положениях предшественник удается включить с разбавлением метки не более, чем в 50 раз, Масс-спектрометрия особенно удобна при работе с соединениями, меченными Н, когда полное дейтерирование предшественника обычно не представляет трудностей и когда желательно избежать проявления изотопных эффектов наглядным примером является широкое использование [Ме 2Нз] метионина для изучения процессов С-метилирования. [c.475]

Метод радиоактивного мечения требует введения экспериментальным животным в область клеточных тел определенных нервных путей радиоактивных предшественников. Так, после инъекции в глаз можно следить за меткой по мере ее прохождения по зрительному пути. Более полная информация может быть получена путем определения распределения радиоактивной метки в зависимости от времени в разрезанном на равные сегменты нерве. Такие определения можно проводить в сочетании с лигатурой или с исследованиями цитоплазмы нервных окончаний при использовании субклеточного фракционирования для их выделения в виде синаптосом. [c.304]

Использование срезов тканей вместо целых плодов, конечно, облегчило бы исследование биогенеза этилена. Берг и Тиманн [25] на тканях яблока разработали точные методы для этой цели. Они обнаружили, что удаление этилена, первоначально присутствовавшего в тканях плода, не влияет на последующее образование этилена и что температурный оптимум синтеза его составляет 32° (при более высокой температуре скорость синтеза очень быстро падает). Если срез, выдержанный нри повышенной температуре, при которой синтез этилена приостановлен, поместить в условия пониженной температуры, то способность к синтезу этилена восстанавливается. Образование этилена и поглощение кислорода, как показали Берг и Тиманн, зависят от напряжения кислорода одинаковым образом. Как и в целом плоде, синтез этилена в срезах прекращался в анаэробных условиях. Однако в анаэробных условиях происходит накопление предшественника этилена, который на воздухе быстро превращается в этилен. Включение метки из воды, содержат,ей тритий, в этилен в тканевых срезах указывает на то, что одним из последних этапов биосинтеза этилена является обратимая гидратация. [c.393]

Метод изотопной метки основан на том, что к растущей культуре прибавляют интермедиат, например меченую глутаминовую кислоту. Она препятствует своему эндогенному синтезу и включается в биосинтез белка. Затем, выделяя и фракционируя белок клеточной популяции, обнаруживают метку и в других аминокислотах, в частности в пролине и аргинине, следовательно, глутаминовая кислота — их предшественник. [c.20]

Метод радиоавтографии представляет собой способ регистрации радиоактивности, в основе которого лежит фотохимическая реакция. В последнее время в биохимических исследованиях радиоавтография все чаще становится естественным дополнением к другим методам обнаружения радиоактивности. Это объясняется следующим во-первых, с помощью метода радиоавтографии можно точно локализовать включение предшественника, меченого радиоактивными изотопами, в совершенно определенные компоненты данной ткани, возможно наблюдение перемещения метки. внутри тканевой системы некоторые изотопы дают возможность локализовать включение метаболита в отдельные компоненты клетки —ядро или цитоплазму, ядрышки, отдельные хромосомы и даже определенные участки хромосом. Во-вторых, с помощью этого метода возможна регистрация включения такого незначительного количества радиоактивных элементов, которое не может быть обнаружено обычными физическими приборами. В-третьих, радиоавтография дает возможность обнаруживать включение меченого предшест- [c.343]

Метод изотопных индикаторов исключительно важен для измерения скоростей процессов, особенно в случае интактных животны.х. Количество любого тканевого компонента может быть довольно постоянным у находящегося в состоянии равновесия взрослого животного, но это постоянство в действительности есть результат равновесия между скоростями синтеза и распада этого компонента. До при.менения изотопных индикаторов не было ни одного удовлетворительного метода для измерения скоростей этих процессов. С помощью изотопных индикаторов проведены исследования двоякого рода. В одном варианте пул данного соединения в организме предварительно метится посредством введения меченого материала, и затем следят за постепенным исчезновением изотопа. В другом варианте вводится меченый изотопом предшественник и исследуется появление изотопа в продукте его превращения. Из скоростей изменения концентрации вещества, содержащего изотопную метку, могут вычисляться скорости его синтеза и распада. Такого рода исследования привели к возникновению Концепции о непрерывном обновлении (синтез, распад и замена) определенных составляющих организма, что отражает динамическое стационарное состояние даже при постоянном составе. [c.391]

Использование гель-фильтрации для освобождения от радиоактивных предшественников неоднократно цитировалось при описании методов введения радиоактивной метки в белки и нуклеиновые кислоты [Остерман, 1983]. Нередко обессоливание используют и на заключительном этапе очистки для освобождения не только от соли, но и от прочих низкомолекулярных примесей. Например, в одной из работ по выделению РНК-полимеразы очисткой белка на биогеле А-1,5т завершалась целая серия операций, включавшая различные варианты переосаждений белка и ионообмениой хроматографии [Vaisius, Horgen, 1979]. [c.138]

Изотопные эффекты при использовании С незначительны, а реакции, приводящие к потере метки, очень редки. Выпускается широкий набор меченных С соединений, пригодных для непосредственного применения или в качестве исходных веществ для синтеза. Однако синтез меченых соединений с достаточно высокой для использования в работах по биосинтезу удельной активностью часто требует особого искусства [104,105] трудности связаны с необходимостью сведёния к минимуму потерь при работе с небольшими количествами веществ и с обеспечением минимального разбавления. Для получения сложных меченых метаболитов и их последующего включения часто применяют биосинтетическое включение С из простого предшественника. Эта методика, однако, неизбежно приводит к двукратному разведению меченого соединения, и, соответственно, потери должны быть очень велики. Кроме того, всегда существует опасность, что меченные таким образом природные поликетиды будут легко подвергаться биологическому расщеплению с образованием значительных количеств специфически меченного ацетата. Методы обнаружения радиоактивности настолько чувствительны, что такого рода непрямое включение может быть ошибочно принято за непосредственное включение необходим внутренний контроль, например, путем одновременного определения включения в какое-либо неродственное соединение типа жирной кислоты. По указанным причинам результаты таких исследований не должны содержать никаких неоднозначных данных, только тогда они будут в принципе приемлемы. [c.471]

В простейших экспериментах с применением С, при которых получаемые результаты эквивалентны результатам работ с радиоактивным С, важнейшим фактором является заметное природное содержание С. Именно этот фактор стимулировал развитие инструментальной техники ЯМР С и сделал реальной интерпретацию спектров. С другой стороны, этот фактор ограничивает чувствительность ЯМР как метода детектирования включенной метки. Если предшественник в каком-то определенном положении мечен на 100%, то, конечно, соответствующие сигналы в его спектре будут интенсивнее сигналов при природной концентрации, составляющей около 1 % Для надежного обнаружения введенной метки ее максимально допустимое разбавление должно быть не выше 100-кратного, а для сколько-нибудь точного количественного определения оно должно быть значительно ниже. Более того, в идеальном варианте необходимо количественное сравнение включенной в несколько различных положений метки здесь уже появляются проблемы, связанные с использованием преобразования Фурье в методе ЯМР. Так, на интенсивность сигналов в спектре ЯМР С заметно влияют релаксационные эффекты, различные для разных атомов углерода эти эффекты трудно воспроизводимы даже в различных спектрах одного и того же соединения. Эта трудность может быть преодолена [70] путем применения парамагнитных релаксационных реагентов , например трис(ацетил-ацетоната)хрома (III) [116, 117], специальных приемов подавле- [c.476]

Уменьшение количеств белков и пептидов, необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный или С-ФИТ1Д. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазолиноны, позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-koh-цевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости. [c.79]

Общим методом детектирования нуклеиновых кислот в элюатах является измерение УФ-поглощения при 260 нм. В тех, случаях, когда нуклеиновые кислоты вследствие включения меченых предшественников содержат радиоактивную метку (Щ, или Р), спектрофотометрия дополняется более чувствительным методом определения радиоактивности. Кроме того, качественный и количественный анализы фракций можно проводить колориметрически, с реактивами, используемыми обычно для определения нуклеиновых кислот в экстрактах из тканей [32] орцина в случае определения РНК [33] и дифениламина в случае определения ДНК [34]. Для этих же целей используют специфические нуклеазы (ДНКаза, РНКаза, РНКаза Н, нуклеаза из Кеигоз-рога, фермент Лемана и т. п.) [c.68]

Методы введения тритиевой метки можно разделить на две основные группы различные варианты изотопного обмена и химические методы. В свою очередь, методы изотопного обмена подразделяются на реакции с газообразным тритием и реакции с тритиевой водой, а химические методы — на методы введения метки гидрированием или дегалоидированием газообразным тритием методы восстановления тритийсодержащими реагентами соответствующих предшественников методы с использованием конденсации сложных немеченых фрагментов с мечеными реагентами на последних стадиях синтеза или с использованием меченых предшественников в многостадийном синтезе. Кроме того, возможно превращение одних меченых соединений (полученных химическими методами или изотопным обменом) в другие ферментативными и химическими методами. Формулы ряда препаратов, в которые вводили метку перечисленными выше методами, приведены на соответствующих рисунках. [c.485]

Химические методы введения тритиевой метки. Введение метки методами гидрирования, селективного гидрирования, дегалоидирования и селективного дегалоидирования (молярные радиоактивности препаратов в приведённых примерах достигали нескольких ПБк/моль) в этой работе уже подробно описано. В данном разделе будут рассмотрены другие подходы введение метки восстановлением соответствующих предшественников комплексными тритидами металлов, конденсацией соответствующих предшественников с мечеными реагентами, химическим синтезом. [c.522]

Такой подход связан с невозможностью введения метки в конечный продукт из-за крайней неустойчивости его в условиях получения высокомеченых соединений. Таким образом, изотопный обмен более предпочтителен, когда соединение устойчиво в условиях обработки его газообразным тритием или тритиевой водой в присутствии катализаторов (при этом не нужны дорогостоящие предшественники). При необходимости получения лабильных высокомеченых соединений, содержащих метку в определённых положениях, достичь поставленной цели невозможно без использования химических методов введения метки. [c.525]

Роль стереохимии была понята уже почти столетие назад, но основные успехи в ее развитии достигнуты лишь в последнее десятилетие. Один из методов управления пространственной структурой состоит в том, что к реагенту присоединяют дополнительный молекулярный фрагмент определенной хиральности. Если правильно расположить такую хиральную метку , она будет определять хиральность продуктов реакции, образуюищхся из этого реагента. Затем хиральную метку можно удалить из продукта и снова использовать ее в другом цикле. Этим методом, например, были получены некоторые хиральные пропио-наты, использованные далее в качестве предшественников других биологически активных молекул. Еще более широкие перспективы открывает применение асимметрических (хиральных) катализаторов для управления хиральностью продуктов. Так, асимметрическое восстановление является основной стадией в промышленном синтезе важного лекарственного препарата леводофы, предназначенного для лечения болезни Паркинсона. Более общее назначение имеет асимметрическое эпоксидирование на асимметрических катализаторах. Если атом кислорода при образовании эпоксида способен присоединяться с равной вероятностью к двойной связи с любой стороны, то образуются два эпоксида, один из которых является зеркальным отражением другого. В настоящее время стало возможным получать любой их этих стереоизомеров, применяя недорогой хиральный катализатор, котоый можно использовать многократно. А полученные таким образом оптически чистые эпоксиды могут служить исходными со- [c.156]

Изотопные методы исследования показали, что это соединение должно играть роль основного предшественника терпенов и стеринов. Если в качестве исходного соединения используется ацетат, меченный по карбоксилу, то характер расположения метки в мевалоновой кислоте должен, разумеется, отличаться от того, который наблюдается при использовании ацетата, меченного по метилу. [c.575]

Наряду с прочими здесь можно упомянуть метод спиновой метки [17], при котором короткоживущне радикалы вступают в реакцию с нитрозосоединениями или нитронами с образованием стабильных радикалов. При этом радикальный характер промежуточной частицы сохраняется в продукте улавливания, причем аддукт-радикал, который является кинетически устойчивым в условиях реакции, накапливается до таких концентраций, которые можно обнаружить методом спектроскопии ЭПР. Из спектров во многих случаях можно вывести структуру первоначального радикала. Существенно, что нитрозосоединения и нитроны инертны по отношению к большинству предшественников активных радикалов. [c.180]

Очень важный вопрос для понимания всего процесса образуется ли белок после индукции заново из аминокислот или он существует в клетке в форме неактивного, но высокомолекулярного предшественника (зимогена) . Для решения этой проблемы Хогнес, Моно и Жакоб применили метод изотопной метки, [c.486]

Биогенетическое правило изопрена предсказывает, что соясапогенол-А, который получается при биосинтезе из 2-С -МВК через сквален, должен содержать 6 радиоактивных атомов углерода, расположенных в положениях, указанных в формуле С1. При окислении этого вещества по методу Куна — Рота образуется уксусная кислота, меченная почти исключительно по метильной группе и в количестве, почти равном рассчитанному для содержания двух меченых метильных групп в молекуле [69]. Поскольку было найдено, что —СНгОН-группа при С4 метки не содержит, она должна была, следовательно, возникнуть из Сз-метильной группы МВК- Отсюда следует, что если сквален действительно является предшественником соясапогенола-А, то при его циклизации цепь атомов, составляющих потенциальное кольцо А, должна принять такую кресловидную [c.475]

Биосинтез хлорамфепикола являлся предметом многочисленных экспериментальных и теоретических исследований, и они привели к осуществлению крупномасштабного производства антибиотика уже в тот период, когда еще не существовало эффективных химических методов синтеза. Поскольку 7 является продуктом микробиологического превращения, то, изменяя условия выращивания культуры и отбирая мутанты, можно максимально увеличить выход желаемого метаболита. Одно из важнейших условий выращивания культуры (которое можпо легко варьировать) — присутствие специфических субстратов, способных выступать в роли достаточно эффективных предшественников метаболита. Это условие положено в основу методики исследования путей биосинтеза, ибо меченые предшественники можно использовать для измерения суммарных скоростей включения метки и для определения происхождения отдельных атомов в конечном метаболите. [c.164]

Исследователь оказывается перед выбором, изучать ли ему фракции гяРНК, имеющие самые большие размеры (и отличающиеся от предшественников рРНК, поскольку их константы седиментации >458), или избирательно ингибировать синтез рРНК актиномицином. При использовании другого метода в течение короткого времени наблюдают за судьбой импульсной (т. е. очень кратковременной) радиоактивной метки, которая включается в гяРНК гораздо быстрее, чем в рРНК. Ни один из этих подходов не дает абсолютно убедительных результатов, но они вполне адекватно отражают общие свойства транскрипции, происходящей в нуклеоплазме. [c.332]

Секретированная форма НА оказывается отличной от белка связывания мембраны дикого типа только в одном отношении — в скорости его гликозилирования. Добавка углевода к белкам происходит в две стадии. Как только образующийся белок появляется на открытой просвету потока стороне грубого эндоплазматического ретикулума, преформированные богатые сахарозой олигосахариды переносятся от липидного носителя к определенным аспарагиновым остаткам [13, 21]. Это первоначальное котрансляционное гли-козилирование кора является только первым шагом в тщательно разработанной программе реакций, которые происходят в грубом эндоплазматическом ретикулуме и позднее в аппарате Гольджи, где сахара упорядочены и добавлены к образующемуся белку [13, 26]. Во время биосинтеза НА переход от гликозилированной по кору молек5щы к полной молекуле можно наблюдать при анализе методом SDS-гель-электрофореза белка, меченного S-метионином, или меченных тритием предшественников сахаров в экспериментах с пульсовой меткой. Конечный состав олигосахаридных боковых цепей на завершенных белках штамма дикого типа и А -бел-ках оказывается одинаковым. Однако в противоположность белку связывания мембраны дикого типа, который быстро и относительно синхронно гликозилирован, популяция секреторных молекул становится терминально-гликозилированной через очень длительный период. Возможно, это различие в некоторой степени отражает относительную эффективность, с которой белки связывания мембраны и относящиеся к просвету потока белки изолируются в транспортные везикулы, перемещаемые от грубого эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи. [c.183]

Изучение способов сегрегации поверхностных слоев осуществляется методом введения в эти структуры меченых предшественников с последующим прослеживанием их судьбы через несколько генераций после переноса клеток в среду, не содержащую метки (ри18е-сЬа8е — эксперименты). Другой метод прослеживание образования определенных компонентов поверхностных структур после их индукции с целью выявления распределения на поверхности клетки новообразованных участков. В этом случае вместо меченых предшественников удобно использовать специфические маркеры клеточной стенки (рецепторы фагов, колицинов, а также матриксные белки) или цитоплазматической мембраны (интегральные мембранные ферменты), а также такие общие маркеры, как жгутики. [c.66]

В первые десятилетия работы с тканевыми культурами трансформации одних клеточных форм в другие привлекали основное внимание исследователей. Многие авторы занимались изучением переходных типов клеток в надежде получить сведения о клеточных превращениях в культурах. СО временные исследователи ставят прежде всего вопрос, служит ли изменение состава клеточной популяции in vitro результатом трансформации клеток или селекции. Появление таких методов, как хромосомные маркеры, тимидиновая метка, клонирование, обеспечивает новые возможности при разработке этой проблемы Поиски морфологических переходов в культурах, которые в течение многих лет волновали исследователей, в значительной степени потеряли свою остроту. Это связано, во первых, с тем, что морфологически идентичные клеточные формы не являются однородными. Например, популяция малых лимфоцитов, имеющих одина ковую морфологию, представлена набором клеток, осуществляющих различные функции одни из них это антиген-распознающие лимфоциты, происходящие из тимуса, другие — антигенчувствительные лимфогшты костномозгового происхождения, третьи, возможно, представляют собой стволовые кроветворные клетки, а четвертые — иммунные лимфоциты, осуществляющие реакции замедленной повышенной чувствительности. Во-вторых, и это особенно важно, концентрация клеток-предшественников, служащих исходными для определенных гистогенезов в популяциях кроветворных и лимфоидных клеток, как правило, крайне низка. Так, для стволовых кроветворных клеток в костном мозге она составляет 10 , для антителосинтезирующих клеток-предшественников в селезенке для клеток-предшест- [c.148]

Первое затруднение связано с обезличенностью радиоактивного излучения. Например, если в результате некоего эксперимента мы регистрируем излучение радиоактивного изотопа углерода, то само это излучение никоим образом не информирует нас о том, находятся ли атомы радиоактивного углерода в молекулах интересующего нас белка или в каких-то посторонних для данного эксперимента примесях. Природа этих примесей зависит не только от способа очистки препарата, но и от метода введения радиоактивности в интересующие нас биополимеры. Если оно осуществляется естественным путем биосинтеза в организме животного, которому с диетой или в виде инъекции ввели низкомолекулярные радиоактивные предшественники , то не во власти экспериментатора проконтролировать все процессы метаболизма, в которых эти предшественники могут быть использованы. Если же радиоактивная метка вводится в уже очищенный биологический препарат in vitro химическим или энзиматическим путем, то, помимо возможности побочных реакций, всегда существует проблема полного отделения продукта от использованных в реакции исходных радиоактивных соединений. В связи с этим методам введения радиоактивных изотопов в молекулы биополимеров и способам очистки продуктов такого введения от радиоактивных загрязнений будет уделено значительное внимание. [c.155]

При изучении сегрегации поверхностных слоев также используют введение в эти структуры меченых предшественников с прослеживанием их судьбы через несколько генераций после переноса клеток на среду, не содержащую метки (так называемые эксперименты риЬе-сказе). Наблюдения обычно осуществляют методом электронно-микроскопической радиоавтографии, где в качестве метки используется тритий (Н ), который в силу небольшой энергии р-частиц дает на радиоавтографах короткие треки, удобные для определения мест локализации метки. [c.114]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология