Концентрация белка, ее определение поглощению

Возможно прямое определение белка путем измерения оптической плотности (поглощения) при 280 нм, основанное иа присутствии в белке остатков тирозина и триптофана. Зная удельный коэффициент экстинкции е (оптическая плотность 1%-иого раствора белка при 280 им и длине оптического пути 1 см), можно, исходя из измеренной экстинкции раствора белка неизвестной концентрации, установить содержание белка (в мг/1 мл). [c.356]

Пептиды и белки обладают сильным избирательным поглощением в области 210—220 нм. Однако при этом нельзя работать в буферных растворах, включающих карбонил со держащие соединения. Еще более чувствительным является определение пептидов при 192—194 нм, однако при измерении в этой области можно использовать лишь водные растворы фторидов щелочных металлов. По этой причине спектрофотометрическое определение белков в области ниже 210 нм используется крайне редко (лишь в специальных случаях ГПХ). По чувствительности определение белков при 210 нм сопоставимо с колориметрическим методом Лоури, Например, сывороточные белки определяли в концентрации 2 мкг/мл [79]. Поглощение при 210 нм характерно для пептидной связи, и, следовательно, белки имеют одинаковые коэффициенты экстинкции (табл. 35.8). [c.457]

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Измеряя оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм, содержание белка рассчитывают с помощью номограммы (рис. 6) экспериментально полученные величины оптической плотности при 260 и 280 нм находят в соответствующих столбцах номограммы и соединяют их прямой линией точка пересечения этой прямой со шкалой, на которой дана концентрация белка, определяет содержание белка в исследуемом растворе. [c.83]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА ИЗ ДАННЫХ ПО УФ-ПОГЛОЩЕНИЮ [c.38]

Как известно из классических работ Ж. Перрена, вес очень больших частиц механических взвесей, как, например, взвесей гумми-мастикса, может быть определен на основании скорости их оседания под влиянием силы тяжести. Сила тяжести слишком мала для аналогичного осаждения макромолекул из растворов белков. Однако этого аффекта можно добиться, заменяя силу тяжести центробежной силой. Для этой цели применяют центрифуги с 60 ООО об мин, в которых осуш,ествляются центробежные силы, превышаюш,ие в 300 ООО раз силу тяжести. Раствор белка помещают в кювету с кварцевыми окошками, которую вводят в ротор центрифуги. Осаждение белка измеряют в процессе вращения, наблюдая по изменению показателя преломления или поглощения света за градиентом концентрации белка в зависимости от расстояния от оси вращения. [c.429]

В Присутствии примесей, поглощающих в ультрафиолетовой области при 260—280 нм, например компонентов нуклеиновых кислот, определение белков по поглощению при 220 нм идентично колориметрическому методу Лоури. Показано, что при этом можно работать в растворах хлористого натрия, какоди-лата, бората, фосфата натрия и калия, сульфата аммония (при концентрации выше 0,1 М), тогда как концентрация гидроокиси натрия, ацетатов, глицина, трис-буфера не должна превышать [c.458]

Мы рассмотрели только те методы количественного определения белка, которые могут быть особенно полезны для наблюдения за ходом выделения и очистки. Известно немало других, менее универсальных, методов, применяющихся для решения других задач. К ним относится, например, определение концентрации белков в сыворотке крови по удельному весу последней — метод весьма ценный для клинических анализов.. Заслуживает особого упоминания и весьма чувствительный метод определения белка по поглощению ультрафиолетового света с Я = 200 220 ммк (область поглощения пептидными группами белка). Его распространение сдерживается пока крайней дефицитностью соответствующей аппаратуры. [c.34]

В ходе выделения белков обычно требуется иметь подходящий метод контроля эффективности процесса. Для определения концентрации белка в растворе пользуются количественным методом, который основан на измерении интенсивности поглощения (рис. 5) в ультрафиолетовой области спектра при длинах волн около 280 ммк, где поглощение в основном зависит от присутствия в белках ароматических аминокислот — триптофана I и тирозина II [c.19]

Оптический метод широко используется для быстрого неразрушающего определения концентрации белков, например при колоночной хроматографии белков. Однако не любое поглощение при 280 нм можно принимать за белковое, так как нуклеиновые кислоты (максимум поглощения при 260 нм) могут вносить значительный влад в абсорбцию, если присутствуют в пробе. Если измеряемый образец сильно загрязнен нуклеиновыми кислотами, то более точно концентрация белка вычисляется по формуле, учитывающей вклад абсорбции при 260 нм (нуклеиновые кислоты) [c.140]

Определение белка методом Уодделя [12] основано на дифференциальном измерении поглощения при 215 и 225 ммк. Белковый раствор разбавляют раствором Na l (9 г/л) до тех пор, пока экстинкция при 215 ммк не станет меньше 1,5. Разность экстинкции при 215 и 225 ммк, умноженная на 144, показывает концентрацию белка в исследуемой пробе в мг/мл. При работе с индивидуальным белком при определенных условиях возможно точное измерение концентраций белка порядка 5 мкг/л. Из наблюдений Мерфи и Киса [13], Списа и др. [14] и Бендиксена [15] можно вывести некоторые важные замечания [c.270]

Замечание. Добавление 10%-ного ДСН обязательно, поскольку ДСН предотвращает образование осадка при приливании реагента Фолина к образцам, содержащим тритон Х-100. В диапазоне 40—120 мкг зависимость поглощения от количества белка линейна. Допустимое содержание тритона Х-100 в образце составляет <1%, при большей концентрации детергента необходимо добавить соответствующее количество белка-стандарта, чтобы компенсировать образование окраски. Предложено перед определением по методу Лоури удалять тритон Х-100 путем однократной экстракции изоамило-вым спиртом [245]. [c.295]

Регистрацию выхода белков можно вести по УФ-поглощению при 280 нм, но не по поглощению пептидной связи (210—230 нм), так как в этой области сам полибуфер сильно поглощает свет. Полибуфер не мешает окраске белка красителями типа СВВ. Для определения концентрации белка во фракциях можно пспользовать количественные методы, основанные на окрашивании такими красителями. Определение белка по методу Лоури в присутствии пол1[буфера проводить нельзя, так как он связывает ионы меди. [c.336]

Определение белка. Для определения белка используют микро-биуретовый метод (см. с. 81). В случае сиектрофотометрического определения концентрацию белка рассчитывают с учетом коэффициента поглощения Л " 1см=13,2 при 280 нм. [c.234]

При допущении, что молеку. ярпый вес трипсина равен 2-1 0(, 0 и при использовании оптнчсского поглощения для определения концентрации белка. [c.250]

Полезен способ определения тирозина и триптофана, основанный на измерении поглощения ими ультрафиолетовых лучей [160]. У тирозина максимум поглощения расположен при 275 M , у триптофана — при 280 лг,и. Фотометрию в з льтрафио-лете используют также для определения содерл ания этих аминокислот в белках [160]. По интенсивности поглощения в ультрафиолетовой части спектра можно измерять концентрацию белка в растворе [161—165] (поглощение обусловлено в основном присутствием в белке остатков тирозина, триптофана и, в меньщей степени, фенилаланина). При этом обычно требуется поправка на поглощение в ультрафиолете за счет нуклеиновых кислот (их учитывают по величине оптической плотности при 260 ,i) [165]. [c.44]

СО—обладающего характерным максимумом поглощения при 555 нм. Интенсивность окраски определяется в данном случае лишь количеством пептидных связей. Биуретовая реакция пригодна для определения белка в концентрации 0,25— 25 мг/мл, причем выход окраски стандартизуют по чистому белку. Биуретовую реакцию можно проводить в пробирках и в проточной системе. 0,1—4 мл раствора белка (1—5 мг белка) разбавляют до 5 мл раствором А (0,85%-ный хлорид натрия), прибавляют 5 мл раствора Б и полученную смесь нагревают на водяной бане при 32 °С в течение 30 мин. Количество белка определяют путем измерения оптической плотности при 555 нм. Раствор Б готовят следующим образом к раствору виннокислого калия—натрия (45 г) прибавляют при перемешивании 15 г сульфата меди uS04 5НгО, 5 г иодида калия и разбавляют до 1 л 0,2 М гидроокисью натрия (не содержащей углекислого натрия). Раствор гидроокиси натрия готовят путем нагревания до 90 °С 50%-ного едкого натра в течение 24 ч и после отделения от выпавшего углекислого натрия разбавляют прокипяченной водой. [c.456]

Поглощение ультрафиолетового излучения. Большинство белков поглощает ультрафиолетовое излучение с длиной волны около 280 тр. Было показано1 [91—94], что это поглощение обусловлено тирозином, триптофаном и (в меньшей степени) фенилаланином. Таким образом, величина поглощения зависит от содержания этих аминокислот в белке. Измерение оптической плотности белкового раствора при 280 пу служит удобным и точным методом определения концентрации белка [95], если известен коэффициент экстинкции и в растворе нет других веществ, поглощающих свет с этой длиной волны. Рассматриваемый метод можно также применять для приближенного измерения общего содержания белков в смеси в тех случаях, когда допустимо использование среднего коэффициента экстинкции. Метод имеет то преимущество, что на поглощение света не влияют растворенные соли и многие другие вещества и что, следовательно, определение можно производить на образцах белковых фракций без всякой специальной их подготовки, Анализ производится быстро, причем требуются всего лишь доли миллиграмма белка. [c.20]

Тот факт, что иногда вещество, выделяемое в слишком малых для детектирования оптическими методами количествах, можно хроматографировать благодаря наличию у него биологической активности, часто приводит к двум неверным предпосылкам. Считают, что 1) если удается определить активность и ее распределение строго локально, то этой активности будет соответствовать одиночный пик белка, и 2) если удается выделить одиночный пик активного белка, то можно определить его аминокислотную последовательность. Однако эти ожидания редко реализуются на практике. Например, для детектирования белка по поглощению в ультрафиолетовой области необходимо 50 нг активного белка (разд. VI). Даже если удается получить белковый пик такой интенсивности, это не означает, что количества белка достаточно для анализа состава и последовательности аминокислот (Shively, 1985). Известно, что при использовании газовых анализаторов удается получить определенную информацию, имея 5 пмоль белка, однако в большинстве микрометодов для секвенирования требуется не менее 50—500 пмоль (Hunkapiller et al., 1984), т. е. 1,5—15 мкг для белка с мол. массой 30 ООО. Получение даже минимального количества препарата белка для секвенирования с чистотой 80—90% может оказаться весьма непростой задачей, если в исходном веществе концентрация белка составляет несколько пикомолей. [c.129]

В спектрофотометрическую кювету помещают 0,05 М пирофосфатный буфер pH 9,0 (2,5 мл), гидразин (конечная концентрация — 20 мМ), глицерол-З-фосфат (конечная концентрация — 1,8 мМ), НАД+ (конечная концентрация — 1,2 мМ), Объем пробы доводят до 3 мл. Реакцию начинают добавлением 30—50 мкл раствора фермента. Измеряют нарастание поглощения при 340 нм. Определение белка проводят спектрофотометрически, учитывая, что при 280 нм Лп м=7,4. [c.267]

Цвет голубой, имеются максимумы поглощения и в УФ-области. Вещество пригодно для определения свободного объема колонок с сефадексами и агарозными гелями рекомендуемая концентрация 0,2—-0,5%. Возможно взаимодействие голубого декстрана с некоторыми белками (с образованием растворимых комплексов). [c.394]

Количественное определение белков. Для колич. онределения Б. устанавливают общее содержание азота по методу Кьельдаля (см. Ааота определение). Кроме того, используют колориметрич. методы, основанные на различных цветных реакциях Б., напр, биуретовой, а также реакции Лаури, представляющей сочетание биуретовой реакции и реакции Фолина на ароматич. аминокислоты. Концентрации Б. в р-рах можно установить по поглощению в УФ-области спектра, измерением плотности и показателей преломления р-ров. Количественно аминокислотный состав Б. определяют гидролизом Б. и после- [c.193]

ИЗОИОИНАЯ ТОЧКА (изопротонная точка) — концентрация водородных ионов в растворе белка, при к-рой белок поглощает из раствора одинаковое количество ионов Н+ и ОН. Это определение приложимо не только к белкам, но и к другим амфотерным полиэлектролитам, напр, к полилизин-полиглутаминовой к-те, к сополимерам акриловой к-ты и 2-винилпиридина и др. Вследствие равного поглощения обоих видов ионов белок или другой амфотерный полиэлектролит при внесении в такой раствор не изменяет его pH, что является одним из методов экспериментального определения И. т. Дру-гой метод онределения И. т. заключается в том, что к белковому р-ру добавляют различные количества кислоты или щелочи и измеряют равновесное pH водородным или стеклянным электродом. По кривым титрования белков измеряют ход поглощения ионов Н и ОН" в зависимости от pH и определяют значение pH, при к-ром поглощение обоих ионов равно нулю (кривая поглощения пересекает ось pH). [c.74]

При центрифугировании под действием центробежных сил между слоем воздуха и раствором образуется граница, называС мая мениском. Вместе с тем происходит седиментация растворенных веществ, в результате чего образуется граница раздела между чистым растворителем и раствором белка, которая постепенно смещается ко дну ячейки. Поскольку всегда происходит диффузия высокомолекулярных частиц из раствора в растворитель, то граница раздела не представляет собой плоскости, а всегда несколько размыта. Естественно, что степень поглощения света при переходе от растворителя к раствору будет меняться хотя и круто, но постепенно, равно как и изменение концентрации седиментирующих молекул. Если через такую систему пропустить ультрафиолетовый свет, то это изменение концентрации может выразиться в неодинаковом почернении фотопленки по длине ячейки. В месте границы раздела будет происходить изменение степени почернения пленки от максимального для непоглощающего растворителя до минимального для поглощающего раствора (рис. 39, а). Определяя степень почернения путем микрофотомет-рирования, можно получить кривую распределения концентрации седиментирующего белка. Проведя такие измерения через определенные промежутки времени седиментации, можно получить кривую распределения концентрации вдоль радиуса ячейки. При этом обработка фотопленок, при использовании абсорбционных оптических систем, позволяет сразу получить интегральные кривые седиментации (рис. 39, б). Абсорбционные системы, снабженные кварцевой оптикой, используются чаще всего для исследования разбавленных растворов нуклеиновых кислот и их производных. [c.144]

При экспериментальном использовании метода центрифугирования необходимо учитывать следующие особенности для этого метода также существует зависимость определяемых констант седиментации и диффузии от концентрации. В связи с этим (так же как и при измерении осмотического давления) необходимо проводить измерения в наиболее удобном интервале концентраций и экстраполировать полученные результаты к нулевой концентрации. Чем лучше растворитель, тем более вытянуты молекулы и тем круче ход концентрационной зависимости поэтому не следует применять слишком хорошие растворители. Изменение концентрации, состоящее при седиментации в снижении концентрации полимера в растворе в верхней части камеры, а при диффузии — в повышении концентрации полимера в растворителе, часто может быть определено оптически (в корпусе центрифуги имеется окно). Для этого применяются методы абсорбции, рефракции или интерференции. Для определения изменения концентрации может быть использовано поглощение света, если по крайней мере в одной определенной волновой области растворенные или суспендированные частицы поглощают значительно больше света, чем растворитель. Это имеет место для растворов красителей или суспензий пигментов. Различные типы белков также имеют в ультрафиолетовой области спектра сильные полосы поглощения. Полистирол имеет одну полосу поглощения при длине волны менее 290 лщ. Таким образом, по фотометрическим кривым можно сделать вывод об изменении концентрации полимера. Метод рефракции основан на изменении показателя преломления при изменении концентрации в местах изменений концентрации образуются оптические неоднородности, почти количественно определяемые по методу шкалы Ламма. Филпот и Свенсон предложили целесообразное расположение линз, которое так фиксирует изменение показателя преломления, что на экране или фотографической пластинке возникает кривая, которая непосредственно характеризует изменение концентрации. Для полимолекулярных веществ при седиментации концентрационное распределение соответствует молекулярному распределению получающиеся кривые имеют форму, приведенную на рис. 10. Метод интерференции применим только к диффузионным измерениям. [c.156]

При определенных стерических условиях в молекуле образуются внутримолекулярные водородные связи, т. е. и донор, и акцептор относятся к одной молекуле. Энергии внутри- и межмоле-куляр ых водородных связей одинаковы. Их распознают по поведению при изменении концентрации раствора. При сильном разбавлении межмолекулярные водородные связи разрываются, о чем можно судить по появлению полос поглощения несвязанных ХН-групп. В то же время внутримолекулярные водородные связи оказываются независимыми от степени разбавления. Поскольку образование водородной связи возможно лищь при определенном расположении донора и акцептора, эту связь можно использовать для идентификации молекулярных конфигураций. В этом отноще-нии особое место занимают водородные связи в целлюлозе [514] (см. разд. 6.11). Велика их роль и в стабилизации спиральной конфигурации белков в растворе. [c.130]

Присутствие белков в высоких концентрациях усиливает поглощение при 492 ммк, но максимум поглоп1,ения соответствует большим длинам волн. Влияние этих примесей можно почти полностью исключить для этого после завершения реакции реакционную смесь встряхивают с равным объемом хлороформа. Чтобы удалить эмульгированный х горо-форм из водной фазы, жидкость центрифугируют или оставляют на ночь для отстаивания [9] и спектрофотометрпруют водную фазу. Оптическая плотность, обусловленная гексозамииом, возрастает примерно на /3 по сравнению с первоначальной. Точность количественного определения увеличивается при применении дихроматических измерений при 492 и 520 ммк. Разность />490 — -Опго только на 25% меньше, чем 492, и является линейной функцией концентрации гексозамина. Величина коэффициента экстинкции для п-галактозамина на 5%1 меньше его величины для ю-глюкозамина. Окраска раствора устойчива. [c.51]

Существенно, что распределение растворенного вещества в кювете должно регистрироваться в ультрацентрифуге в момент ее вращения на большой скорости. В первоначальных экспериментах Сведберга [446 —448] это достигалось измерением поглощения света растворенным веществом. С этой целью раствор фотографировали в свете с определенной длиной волны, и концентрация в различных участках кюветы рассчитывалась по относительному почернению фотографической пластинки. Этот метод обладает большими преимуществами при работе с некоторыми образцами биологического происхождения (например, белками и нуклеиновыми кислотами), которые имеют широкие полосы поглощения в ультрафиолетовом свете и, следовательно, подходящие значения оптической плотности могут быть получены при очень сильном разбавлении [453]. Как будет показано ниже, при интерпретации данных, полученных при таких концентрациях, когда отклонения от закона Рауля становятся заметными, возникают определенные осложнения, и поэтому чрезвычайно н елательно работать с как можно более разбавленными растворами. [c.158]

На минимум иоглощения белков, наблюдаемый приблизительно ири 248 нм, оказывает большое влияние примесь нуклеиновой кислоты, а минимум спектра поглощения нуклеиновых кислот, лежащий вблизи 228 нм, служит еще более чувствительным индикатором примеси белков (все белки сильно поглощают в этой области) [141]. Особенности кривой поглощения белков при нейтральном значении рИ и те изменения в характере этой кривой, которые происходят под влиянием щелочи, добавленной до концентрации 0,1 М, можно использовать для идентификации и количественного определения в них тирозина и триптофана [131]. По характеру спектра поглощения белков и нуклеиновых кис.лот можно судить таки<е и об их конформации. Так, денатурация белков обычно сопровождается заметными изменениями их спектра поглощения (главным образом незначительный сдвиг максимума поглощения в сторону более коротких длин волн). По спектру поглощеиия можно судить и о состоянии нуклеиновых кислот (гипер- и гинохром-ный эффекты). При этом в зависимости от температуры и ионной силы различия в поглощении между ними соста-в.ляют 20—40%. И наконец, определение характерных спектров поглощения компонентов нуклеиновых кислот используется в большинстве методов идентификации и количественной оценки этих комионентов (см. разд. А гл. VI). [c.59]

По синтез АТР - это не единственный процесс, идущий за счет энергии электрохимического градиента. В матриксе, где находятся ферменты, участвующие в цикле лимонной кислоты и других метаболических реакциях, необходимо поддерживать высокие концентрации различных субстратов в частности, для АТР-синтетазы требуются ADP и фосфат. Поэтому через внутреннюю мембрану должны транспортироваться разнообразные несущие заряд субстраты. Это достигается с помощью различных белков-переносчиков, встроенных в мембрану (см. разд. 6.4.4). многие из которых активно перекачивают определенные молекулы против их электрохимических градиентов, т. е. осуществляют процесс, требующий затраты энергии. Для большей части метаболитов источником этой энергии служит сопряжение с перемещением каких-то других молекул вниз по их электрохимическому градиенту (см. разд. 6.4.9). Папример, в транспорте ADP участвует система антипорта ADP-ATP при переходе каждой молекулы ADP в матрикс из него выходит по своему электрохимическому градиенту одна молекула АТР. В то же время система симпорта сопрягает переход фосфата внутрь митохондрии с направленным туда же потоком П протоны входят в матрикс по своему градиенту и при этом ташат за собой фосфат. Подобным образом переносится в матрикс и пируват (рис. 7-21). Энергия электрохимического протонного градиента используется также для переноса в матрикс ионов Са , которые, по-видимому, играют важную роль в регуляции активности некоторых митохондриальных ферментов большое значение может иметь и поглощение митохондриями этих ионов для удаления их из цитозоля, когда концентрация Са в последнем становится опасно высокой (см. разд. 12.3.7). [c.443]

Сравнение поглои ения при 280 и 260 нм. Большинство белков имеет максимум поглощения при 280 им, что обусловле-1Ю содержанием в них остатков триптофана и тирозина. Нуклеиновые кислоты, присутствующие часто в виде примесей к белкам, также сильно поглощают при 280 нм, но максимум поглощения этих соединенир находится при 260 нм. Барбург и Христиан экспериментально определили коэффициенты экстинкции различных белков и нуклеиновых кислот при 280 и 260 нм и нашли отношение этих коэффициентов (фактор F табл. 8.3) предложен дифференциальный метод определения белка в интервале концентраций 50—500 мкг/мл. [c.300]

Его полоса поглощения (360 им) перекрывается с полосой Соре в гемовых белках, что затрудняет количественное определение числа присоединившихся остатков DPG-диамина и спектрофотометрическое определение концентрации модифицированного гембелка. Водорастворимый карбодиимид, содержащий хромофорную группу (иoдмeтилaт-N-n-фeнилaзoфeнил-N -(N, К -диметиламино-пропил) карбодиимид) нередко образует с белками неустойчивые соединения, которые разрушаются при хроматографической очистке модифицированного белка [Угарова и др., 1982]. [c.113]