Методы очистки пептидов

Методы очистки пептидов [c.114]

Область применения. Качественное и полуколичественное определение аминокислот, получение пептидных карт (метод отпечатков пальцев), микропрепаративное разделение и очистка пептидов. [c.187]

При выборе методов разделения пептидов учитывают физ.-хим. свойства, кол-во и длину молекул разделяемых соединений. Для первичного фракционирования смесей коротких пептидов, содержащих до 15-20 аминокислотных остатков, в большинстве случаев используют ионообменную хроматографию на катионитах. Дальнейшее разделение и очистку проводят с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля. [c.251]

В книге подробно рассматриваются автоматический метод анализа пептидов и белков с помощью ионообменной хроматографии, газожидкостная хроматография аминокислот и пептидов, очистка белков с помощью гель-фильтрации и электрофореза, изучение функциональных групп в белках с привлечением химических методов. Отдельная глава посвящена изучению четвертичной структуры белков. [c.2]

Метод противоточного распределения (ПТР) применялся для очистки многих пептидов, синтезированных твердофазным методом. Хотя для очень хорошего разделения смеси требуется много переносов, большинство пептидов, полученных твердофазным методом, особенно пептидов с молекулами средней длины, довольно чистые после отщепления от полимера-носителя, и для их очистки достаточно небольшого количества переносов, обычно от 100 до 300 переносов. Преимущество противоточного распределения состоит в том, что с помощью этого метода можно обрабатывать довольно большие количества вещества с гораздо большей легкостью, чем в случае использования колоночной хроматографии. Кроме того, очистка методом ПТР обычно занимает меньше времени (о деталях метода см. [20, 21, 34]). [c.114]

Ионообменная колоночная хроматография — наиболее широко применяемый метод разделения и очистки пептидов вследствие многогранности и чрезвычайной избирательности этого метода. В одном разделении можно легко обработать значительные количества пептидов (хотя и не такие большие, как в случае ПТР), даже если один цикл разделения продолжается иногда длительное время. В этом разделе дается краткая характеристика различных типов хроматографии. Для высокомолекулярных пептидов и белков рекомендуется применять ионообменники на основе целлюлозы. Основные сведения имеются в сравнительно недавно изданных книгах [2, 36]. Во всех системах растворителей, применяемых для разделения пептидов, используют летучие буферы. [c.116]

Электрофорез и хроматография на бумаге удобны как быстрые методы очистки средних и коротких пептидов (разд. 10.8.2). Электрофорез обычно проводят при pH 6,5, 3,5 и 2,1. При этих [c.356]

Пептиды, образованные при частичном гидролизе, могут быть разделены с помощью целого ряда методов, среди которых наиболее широко применяются гель-фильтрация, ионообменная хроматография и электрофорез на бумаге (гл. 5). Обычно только-часть пептидов можно получить в чистом виде с помощью одного-из этих методов смеси пептидов, полученные при разделении одним из методов, должны быть подвергнуты дальнейшему разделению другим методом. Очистка больших гидрофобных пептидов часто вызывает затруднения, но в подобных случаях с успехом применялись такие методы, как гель-фильтрация в водных растворах кислот (например, в 50%-пой уксусной или муравьиной кислоте) или в растворах мочевины или гуанидингидрохлорида (от 2 дО 8 моль/л). Благоприятным обстоятельством является доступность различных молекулярных сит, широко применяемых на практике для очистки пептидов (табл. 5.6). [c.182]

Каждая стадия реакции, подобной приведенной на рис. 25-7, дает продукт, который необходимо выделить и желательно очистить прежде, чем приступить к следующей стадии синтеза. Опыт работы в лаборатории органической химии подготовил вас, наверно, к тому, что при очистке и выделении органических соединений приходится нередко сталкиваться со значительными трудностями. Почти никогда не удается получить продукт с выходом более 90 или 95%. Последовательность многих реакций, каждая из которых дает продукт с выходом 90%, приведет к очень небольшому общему выходу. Например, синтез из ста стадий, каждая из которых протекает с 90% Ным выходом, позволит получить общий выход, равный 0,90 ° X 100% или 0,003% Таким образом, синтез даже не очень крупного пептида может потребовать огромное количество исходного вещества для того, чтобы продукт не только можно было разглядеть невооруженным глазом, но и провести с ним дальнейшую работу. Ниже описан метод, который позволяет избежать огромных потерь, связанных с непрерывными выделением и очисткой промен уточных продуктов при синтезе пептидов. Этот метод находит очень широкое применение в биохимии. [c.405]

Промежуточный связанный с полимером пептид после удаления растворимых реагентов и побочных продуктов не нуждается в очистке, что позволяет избежать традиционных процедур очистки (перекристаллизация, хроматографирование) и связанных с ними потерь. В принципе такой подход приемлем только в том случае, если все последовательные синтетические реакции идут количественно. Поскольку этого вряд ли можно достичь, метод синтеза на твердом носителе неизбежно приводит к окончательному продукту, загрязненному более короткими пептидами, в которых не-хватает одной или более аминокислот (дефект последовательности). Подобным же образом побочные реакции могут привести к загрязнению пептидами с искаженной и частично выполненной последовательностью. Поэтому успех синтеза на твердом носителе полностью зависит от того, возможно ли очистить конечный продукт от близких побочных продуктов. Для достижения даже умеренной чистоты продукта, получаемого на смоле, необходима очень высокая эффективность реакций образования пептидной связи. Так, для получения декапептида с правильной цепью с выходом 80% необходимо, чтобы выход на каждой стадии образования пептидной связи был около 98 % В случае пептида с 20 остатками аминокислот средний выход увеличивается до 99%. В обоих случаях остающиеся 20 % связанного со смолой пептида имеют более короткие пептидные цепи, в основном на одну или две аминокислоты меньше. Поэтому проблема очистки становится очень трудной. [c.407]

После предварительного фракционирования дальнейшую очистку смеси пептидов удобно производить с помощью электрофореза на бумаге. Существует четыре разновидности этого метода 1) вертикальный электрофорез на бумаге без охлаждения [51 ] 2) вертикальный электрофорез на бумаге с охлаждением толуолом [50] [c.37]

Совершенно ясно, что трудности, с которыми сталкивается экспериментатор при работе с гетерополисахаридами, очень велики. Они начинаются при разрешении вопросов о выделении, 1шдивидуализации и очистке гетерополисахаридов, так как ввиду сложности их состава наличие нри.месей. может привести к роковым ошибка.м, влияющим на весь дальнейший ход исследования. В связи с этим так часты противоречивые результаты, с которы.ми можно встретиться н литературе. Противоречия, естественно, объясняются различными методами очистки природных гетерополпсахаридов. Еще большие, для сегодняшнего дня часто не разрешимые, трудности представляет собою установление строения гетерополпсахаридов ввиду пх структурной сложности. Подход к решению этого вопроса в общих чертах напоминает подход к решению вопроса о строении пептидов и белка с топ разницей,, что химия самих мономеров— моносахаридов — сложнее, че,м химия аминокислот. [c.162]

Группы Кнорре [523], Шихана [524] и Подушки [525] уже с середины шестидесятых годов изучали на различных объектах ступенчатый синтез пептидов в гомогенном растворе без выделения промежуточных продуктов, синтез in situ. Отменой утомительных операций очистки на отдельных стадиях синтеза достигается значительная экономия времени. Разработанный Тилаком ПСА-метод (разд. 2.2.5.2.1) и особенно НКА/НТА-метод (метод Хиршмана) (разд. 2.2.5.2.3), который позволяет получать фрагменты пептидов в водном растворе, открыли новые возможности для широкого применения синтезов 1п situ. Методы синтеза пептидов без выделения разрабатывались и позже. [c.213]

Частичная очистка белков и полипептидов может быть достигнута осаждением концентрированными растворами солей, органическими растворителями или путем образования определенных соединений [31, 175]. Для очистки применяются также физические методы ультрацентрифугирование [175], электрофорез [179] и противоточное распределение [36, 187]. При любом методе очистки необходимо иметь критерий гомогенности белка или пептида. Даже кристаллическое состояние не может служить однозначным критерием чистоты [166]. В литературе имеются данные, которые дают возможность предположить, что многие высокоочищенные белки микрогетерогенны [32]. Тесты на гомогенность обычно включают иммунологические испытания, ультрацентрифугирование, электрофорез, диффузию, хроматографию и определение ферментативной или биологической активности [32]. [c.387]

Гель-проникающая хроматография является практически единственным универсальным методом обессоливания, а также очистки пептидов от низкомолекулярных примесей (солей, моносахаридов, мочевины и др.). Исключение составляют очень короткие или триптофансодержащие пептиды. [c.397]

Буассона и сотрудники использовали для защиты N-концевой аминогруппы и е-аминогруппы лизина при синтезе карбобензоксигруппу. При этом карбоксильную функцию С-концевой аминокислоты блокировали переведением в соответствующий метиловый эфир, а укарбоксильиую группу глутаминовой кислоты предварительно бензилировали. Защитные группы (за исключением метилового эфира) удаляли действием бромистого водорода в ледяной уксусной кислоте в условиях, не приводящих к 0-ацилированию гидроксильной группы серина и бензи-лированию тиоэфирной группы метионина. Полученный эйкоза-пептид проявлял очень низкую активность метод очистки подробно не описан. [c.272]

Поскольку бромистый водород довольно плохо растворим в трифторуксусной кислоте, процесс отщепления проводят обычно, пропуская слабый ток безводного бромистого водорода в суспензию пептидил-полимера в трифторуксусной кислоте в течение 60— 90 мин. Отделение пептидов этим методом осуществляется превосходно. Так, при синтезе аналогов брадикинина выход очищенных пептидов составил 85% в расчете на первую аминокислоту, присоединенную к полимеру [128]. Выходы других пептидов колебались в пределах от 85 до 50%. Естественно, что выход снижается, если на какой-либо стадии реакция протекает неполно. Нельзя определять выход пептида после отщепления его от полимерного носителя по сухому весу неочищенного продукта, так как упомянутый реагент отщепляет от полимера также значительное количество непептидного материала, обычно нерастворимого в воде. Этим веществом непептидной природы, как правило, пренебрегают, поскольку его легко удалить любыми методами очистки. Хотя природа его подробно не исследована, можно предполагать, что это вещество представляет продукт разложения самого полимера. Было показано, что отщепление не вызывает перехода а-связи остатка аспарагиновой кислоты в ангиотензине в р-связь [65], хотя при получении одного пептида, содержащего связь остатка аспарагиновой кислоты с остатком серина, был получен в результате промежуточной циклизации р-аспарагиновый пептид [75]. Некоторые исследователи сомневаются в правильности и необходимости длительного отщепления. Почти все пептиды, которые можно отщепить от полимера, отделялись, в конечном счете, в первые несколько минут [30, 65] (см. стр. 88), а при отщеплении ангиотензина [65] в течение более 5 мин получали вещество, которое не расщеплялось лейцинаминопептидазой, хотя электрофоретически оно отличалось от р-аспарагинового пептида. Для отщеп- [c.34]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Мощным методом очистки высокомолекулярных неполярных пептидов является жидкостная хроматография при высоком давлении на неполярных материалах с использованием для элюирования полярных растворителей. Рис. 4.8 иллюстрирует разделение с помощью этого метода тех же бромциано-вых фрагментов фетального глобина человека, которые фигурировали на рис. 4.7. Совместно используя гель-фильтрацию и указанный метод, можно разделить сложные смеси пептидов, полученные путем частичного протеолиза. Для разделения крупных пептидов созданы новые стационарные фазы. [c.36]

Твердофазный метод успешно используют для последовательного построения промежуточных фрагментов. Затем эти фрагменты до связывания можно очистить и довести до ипдивргдуальпого состояния с помощью обычных методов. Поскольку производится очистка индивидуальных фрагментов, такой способ в меньшей степени ведет к образованию смесей близких по строению, но неидентичных пептидов. [c.420]

Для непосредственного анализа первичной структуры Б. обычно используют сек вен а тор-прибор, к-рый с высокой эффективностью осуществляет последовательное авто-матнч. отщепление N-концевых аминокислотных остатков путем деградации Б. по методу Эдмана. Все р-ции проводятся в цилиндрич. стеклянном стаканчике, вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа (рис. 4). Образец Б. распределяется на стенках стаканчика в виде тонкой пленки. Оптимизация процесса и тщательная очистка используемых реагентов и растворителей позволили поднять общий выход реакцин до 95% и выше. Наилучшие объекты для секвенатора-Б. и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков для таких соединений обычно удается определять последовательность 30-35 (в ряде случаев 40-50) [c.252]

Применеиие. Ж х важнейший физ -хим метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов белков ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых к-т, углеводов, липидов, гормонов и т д, изучения процессов метаболизма в живых организмах лек препаратов, диагностики в медицине, анализа продуктов хим и нефтехим синтеза попупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод, изучения изотерм сорбции из р-ра, кинетики и селективности хим [c.153]

Благодаря этому способу удалось заменить весьма сложные и трудоемкие процедуры разделения и очистки промежут. пептидов простыми операциями промывки и фильтрования, а также свести процесс пептидного синтеза к стандартной последовательности периодически повторяющихся процедур, легко поддающихся автоматизации. Метод Меррифнлда позволил существенно ускорить процесс синтеза П. На основе этой методологии созданы разл. тины автоматич. синтезаторов П. [c.471]

О, Ь-N-Meтилвaлин применяется в синтезах пептидов и депсипептидов. В литературе описан метод получения метил-валина из рацемической а-бромизовалернановой кислоты и метиламина в водном растворе [1] или в избытке жидкого метиламина [2]. В данной работе использован метод с жидким метиламином 2], а для выделения продукта применен метод ионообменной колоночной хроматографии, что позволило устранить на стадии очистки абсолютный спирт и получить ко нечный продукт без примеси брома. [c.118]

Методы выделения, очистки и аналитические характеристики пептидов описаны подробно в разд. 3.3. Изучение связи между строением и биологической функцией пептидов ведет к познаванию молекулярного механизма их действия. При этом главное внимание обращается на выяснение активного центра и определение аминокислотной последовательности, которая ответственна за рецепторное связывание, транспорт и иммунологическое поведение. Большой практический интерес имеет также модификация природных пептидов для пролонгирования их действия и расширения практического применения. Такого рода исследования можно проводить только тогда, когда соответствующий природный пептид имеется в достаточном количестве. Необходимые для изучения пептиды можно получать путем частичного ферментативного расщепления экзопептидазами или эндопептидазами или же с помощью специфических химических методов расщепления (бромцианом или Ы-бромсукцинимидом) можно также использовать замещение, элиминирование или превращение функциональных групп соответствующих пептидов. Возможности модификации природных пептидов ограничены тем, что часто исследователь располагает лишь нанограммо-выми количествами этих веществ. [c.90]

В-четвертых, химический синтез иногда проводят из экономических соображений. Например, применяемый для терапевтических целей окситоцин в настоящее время по этой причине получается исключительно химическим синтезом. Это же относится и к некоторым другим пептидам, как, например, к АКТГ и секретину. Синтетический секретин в десять раз дешевле природного продукта, изолированного из свиных кишок. Также обстоит дело и со многими другими активными пептидами. Наряду с вопросами стоимости важную роль играет здесь также доступность пептидов, получаемых химическим синтезом, так как некоторые активные пептиды, как уже упоминалось, встречаются в природе только в нанограммовых количествах. В случае же специфических пептидов человека их получение возможно только синтетическим путем. На примере синтезов АКТГ, глю-кагона и секретина можно показать, что синтетические продукты имеют более высокую степень чистоты, чем пептиды, изолированные из природных источников. Полное разделение родственных по аминокислотной последовательности пептидов с противоположным или другого рода действием часто не всегда возможно с помощью применяемых в настоящее время методов изолирования и очистки. [c.94]

В период между 1944 н 1954 гг. развивались аналитические исследования по выделению, очистке и определению строения пептидов с высокой биологической активностью, а также методические разработки в области синтеза, например в 1950 г. был разработан метод смешанных ангидридов (Виланд, Буассона, Воган). Эти успехи сделали возможным химический синтез природных пептидов, обладающих биологической активностью. В 1953 г. дю Виньо удалось синтезировать первый пептидный гормон — окситоцин. Эта работа была удостоена Нобелевской премии за 1955 г. В следующие годы наступило бурное развитие синтетической пептидной химии, было предложено несколько новых защитных групп, эффективные методы кои-деисаш1и и иовые методические варианты, такие, как разработаниь й Меррифилдом в 1962 г. пептидный синтез иа полимерных носителях. Химический синтез инсулина и рибонуклеазы ознаменовал переход к белковому синтезу. [c.100]

Степень рацемизации прн конденсации и стерическую однородность полученного пептида нельзя ставить в непосредственную связь друг с другом. Так, к примеру, считают, что процесс протекает без рацемизации, если в результате операций очистки происходит более или менее полное разделение стереонзомеров. Из большого числа 0Ш1санных тестов рацемизации ясно, что идеального метода определения рацемизации нет. Все химические тесты испытываются на модельных пептидах. Поэтому распространение полученных результатов на огромное множество пептидных последовательностей, полученных нз 20 протеиногенных аминокислот, по меньшей мере спорно. За неимением лучших методов новые методы сочетания следует испытывать на нескольких различных модельных системах. [c.175]

Используя несомненные преимущества метода Меррифилда, уже сегодня можно сравнительно быстро синтезировать пептидные фрагменты, которые могут быть получены с высокой степенью чистоты при помощи имеющейся теперь техники фракциоиирювания. Конденсация таких фрагментов с помощью обычных методов, позволяющих проводить тщательную очистку и анализ после каждой стадии, указывает путь иа ближайшее будущее. Наряду с этим с помощью твердофазного синтеза следует получать короткие биологически активные пептиды и прежде всего многочисленные аналоги. Хотя трудно установить предел длины цепи, позволяющий использовать этот метод для успешного получения пептидов, но пептиды, включающие 10—15 аминокислот, — вот, по-видимому, предпочтительные объекты синтеза. Главные проблемы, решение которых позволит преодо- [c.194]

Ступенчатое наращивание пептида с применением второй фазы впервые проведено Меррифилдом на примере твердофазного пептидного синтеза (разд. 2.2.7.1). При реакциях в гетерогенной фазе вероятность встречи реагирующих партнеров гораздо ниже, чем в гомогенном растворе. Для получения высокой степени превращения требуется значительный избыток ацилирующего средства. Преимуществом этой стратегии является простота технических операций и связанная с этим возможность автоматизации. Трудные операции очистки промежуточных веществ традиционного синтеза заменяются простыми процессами фильтрования и промывания. Однако на этом пути однородный продукт синтеза получается только в том случае, если каждая реакция в гетерогенной фазе протекает практически количественно. Несмотря на большие избытки карбоксикомпонента, использование которых чревато опасностью N-ацилирования пептидной связи, полное превращение на каждой стадии в настоящее время недостижимо. На практике средний выход на одну стадию 95—99%, что недостаточно для синтеза длинных пептидов или белков. Средние выходы на одну стадию и полные выходы (в зависимости от длины цепи) приведены в табл. 2-10. Как показывает практика, короткоцепочечные пептиды или их аналоги длиной до -15 аминокислотных остатков могут быть получены твердофазным методом. Трудности при синтезе небольших белков наглядно демонстрируются данными табл. 2-10. Еще хуже сказывается накопление не- [c.214]

За последние годы число пептидов, найденных в живых системах, сильно возросло. В период 1944—1954 гг. были разработаны основные аналитические методы выделения, очистки и установления структуры пептидов. Однако исследования некоторых пептидов, особенно пептидов головного мозга, совершенно не развивались, так как были неизвестны соответствующие аналитические методы определения нанограммовых (10" г) или меньших количеств вещества. Лишь с развитием радиоиммунного анализа (RIA) (Р. С. Ялоу, лауреат Нобелевской премии 1977 г. по физиологии и медицине, и С. Берсон) стали возможны определения исключительно малых концентраций пептидов в соответствующих препаратах. Например, некоторые гормоны можно обнаружить при содержании 10" г в 1 мл крови. Развитие радиоиммунного метода позволило начать исследование нейрогормонов гипоталамуса. Гийемен и Шалли (получившие вместе с Ялоу Нобеленскую премию по физиологии и медицине) смогли привести экспериментальные доказательства того, что центральная нервная система модулирует активность гипоталамуса путем выделения ничтожных количеств либеринов (факторы высвобождения гормонов, рилизинг-факторы) тем самым контролируется эндокринная регуляция. Оба исследователя (совершенно независимо друг от друга) установили последовательность первых гормонов гипоталамуса и синтезировали их в лаборатории. [c.230]

Другая возможность применения этого метода — связывание свободными сульфгидрильными группами на подобной матрице и таким образом, что при обработке протеазой отщепляются незакрепленные пептидные участки, которые затем удаляются элю-энтом. Затем содержащие SH-группы пептиды могут быть раздельно элюированы. Чтобы избежать образования дисульфидных мостиков между молекулами в растворе, можно также активировать SH-группы у белков воздействием 2-2 -дипиридилдисульфи-да до проведения переваривания протеазой, а после этого — очистку путем связывания пептидов активированными SH-группами на сорбенте, например тиолсефарозе 4Б с пониженной активностью. [c.84]

Химический синтез полимеров с заданной последовательностью мономерных звеньев может быть очень сильно облегчен присоединением одного конца растущей полимерной цепи к нерастворимой подложке. При этом очистка полимера после каждой стадии химической реакции может легко достигаться фильтрованием. Этот метод был очень популярен в области пептидов, при этом повторяющиеся стадии могут быть автоматизированы [88]. Твердофазный синтез полинуклеотидов не был столь успещен, как твердофазный синтез полипептидов, в основном из-за трудностей в достижении количественных выходов на последовательных стадиях синтеза. Наиболее полезными реагентами для создания межнуклеотидной связи являются аренсульфонилхлориды, хотя для достижения максимальных выходов необходимо обеспечение безводных условий. Полистирол и сщитые стирол-дивинилбензольные сополимеры, содержащие остатки 4-метокситритилхлорида, были использованы для присоединения первого нуклеозида, через его 5 -гидроксильную группу к твердой подложке схема (55) . [c.170]