Белки определение молекулярного веса

Перечень белков, широко применяющихся в качестве стандартов для определения молекулярного веса [c.160]

Для определения молекулярного веса белков почти не применимы обычные методы, основанные на измерении упругости пара, повышения температуры кипения и понижения температуры замерзания растворов. Чаще всего пользуются специальными методами, разработанными для исследования высокомолекулярных веществ определение скорости диффузии, вязкости растворов, ультрацентрифугирование и др. [c.389]

Криоскопия является важным методом определения молекулярного веса растворимых веществ. Этот метод приобретает особенную ценность для таких веществ, какие не могут быть превращены в парообразное состояние (белки, сахара и т. п.). [c.182]

Осторожное выделение белков из живых организмов позволило узнать очень многое о их свойствах. Каждый белок имеет вполне определенный молекулярный вес (от 10000 до нескольких миллионов), а отдельные группы белков можно выделить и исследовать благодаря тому, что каждый из них обладает различной скоростью диффузии. Например, определение молекулярного веса белка осуществляется методом измерения осмотического давления. Многие белки удается получить в кристаллической форме, а это позволяет исследовать их строение методом дифракции рентгеновских лучей. [c.482]

ГПХ можно использовать для определения молекулярной массы и размеров белковых молекул. По методу Эндрюса [4—6] вначале на основании предварительного анализа нескольких белков с известной молекулярной массой строят калибровочную кривую, выражающую графическую зависимость удерживаемого объема Уе от молекулярной массы М. После этого молекулярную массу и стоксов радиус исследуемого белка определяют путем интерполяции. В отличие от других методов определения молекулярного веса здесь можно работать с мало-очищенными препаратами. Если исследуемый белок обладает какими-либо характерными свойствами, например ферментативной активностью или поглощением при определенной длине волны, его содержание в анализируемом препарате может быть минимальным. [c.425]

Определение молекулярного веса биополимера зачастую оказывается чрезвычайно важным. Во многих случаях можно рассчитать минимальный молекулярный вес, исходя из содержания наименьшего из компонентов (например, триптофана в белке или железа в гемоглобине). Однако в большинстве случаев молекулярные веса определяют физикохимическими методами [151, 152]. В принципе это довольно просто сделать, измерив осмотическое давление и светорассеяние, однако и эти методы имеют свои трудности. Наиболее надежные результаты дает ультрацентрифугирование. Прямое определение молекулярного веса ос- [c.181]

Синтетические макромолекулы отличаются от белков и нуклеиновых кислот не только отсутствием первичной структуры. Синтетические полимеры гетерогенны, они состоят из неоднородных макромолекул. Приведенные формулы полимерных цепей идеализированы в том смысле, что реальные цепи зачастую содержат и другие группы, например, некоторые из атомов И в полиэтилене могут быть замещены на метильную группу СНз и т. п. Цепи могут быть разветвлены случайным образом. Любой образец синтетического полимера содержит смесь макромолекул различной длины. Соответственно молекулярный вес полимера является средним значением по всем полимер-гомологам. Напротив, все молекулы данного белка одинаковы, они имеют вполне определенный молекулярный вес, состав и первичную структуру. [c.118]

ДНФ-фр акцию, полученную из смесей с известным количеством белка или пептида, хроматографируют вместе с определенным количеством контрольных ДНФ-аминокислот, после чего ДНФ-аминокислоты элюируют из бумаги и определяют их содержание фотометрически по калибровочной кривой, построенной для ДНФ-аминокислот. Таким способом можно определить концевые группы белков и пептидов, число полипептидных цепей белков, минимальный молекулярный вес белков и аминокислотный состав белковых гидролизатов. [c.272]

В 1935 г. в химии полимеров начали применяться физические методы измерения молекулярных весов применение этих методов к целлюлозе и ее производным рассмотрено в обзоре Кремера и Лансинга [12]. Ультрацентрифуга оказалась особенно ценной при исследовании белков, однако в то время этих приборов было очень мало. Для определения молекулярных весов было также предложено измерение осмотического давления, однако измерения по этому методу занимают много времени. [c.100]

Если хроматографировать в водном растворе такие соединения, молекулы которых не имеют форму компактных глобул, то зависимость / av, или Ve, ОТ молекулярной массы носит аномальный характер. Это явление полностью или частично исчезает, когда хроматографию ведут в концентрированных растворах мочевины или солянокислого гуанидина. В этих условиях полипептидные цепи принимают конфигурацию статистического клубка, а следовательно, исчезают вариации Ve, связанные с формой нативной молекулы. Часто 8—9 М мочевина не дает должного эффекта, напротив, 4—6 М раствор солянокислого гуанидина вызывает полную диссоциацию полипептидных цепей. ГПХ на сефарозе 6В в 6 М растворе солянокислого гуанидина является обычным методом определения молекулярного веса белков в диапазоне 80 10 —1,4 10 дальтон [7] (см. табл. 35.1). На основании эмпирического уравнения [c.428]

Белки занимают особое место среди полимеров, поскольку встречающиеся в природе белки обладают соверщенно определенным молекулярным весом. Поэтому в больщинстве случаев именно белки применяются для калибрования гидрофильных гелей (см. табл. 22). [c.159]

При исследовании белков гель-фильтрация пользуется особым вниманием как простой аналитический метод решения ряда задач, например определения молекулярно-весового распределе-иия в биологических жидкостях, сопоставления размеров белковых молекул, определения молекулярного веса на уровне нескольких микрограммов. Несомненным достоинством метода является возможность одновременного сравнения 30 образцов. [c.263]

Гораздо меньшие затраты на аппаратуру требуются для гель-хроматографии в тонком слое (см. гл. П). В этом случае в конце опыта вместо объема выхода необходимо измерить расстояние от стартовой линии до пятна вещества — длину пробега ]56]. При стандартизации результатов хроматографии на бумаге длину пробега относят к пути, пройденному растворителями (определяют величину / /) в тонкослойной гель-хроматографии длину пробега исследуемого вещества относят к пути, пройденному хорошо идентифицированным веществом [72]. Для белков (а только для них тонкослойная гель-хроматография и применялась до настоящего времени) удается таким образом определять молекулярный вес, имея в распоряжении всего несколько микрограммов вещества [56, 72, 73]. В качестве стандартов здесь также используются белки, приведенные в табл. 22. Из фиг..36 видно, что отношение длины пробега ряда белков к пути, пройденному цитохромом с, является линейной функцией от логарифма молекулярного веса. Как показывает опыт, эту калибровочную линию нельзя считать достаточно универсальной, поскольку ее наклон довольно сильно изменяется от одной серии экспериментов к другой. Результаты определения молекулярного веса становятся более точными, если соответствующие стандартные белки наносят на каждую пластинку. Это вполне возможно, так как на пластинку шириной 20 см свободно можно одновременно нанести по меньшей мере 10 образцов. Благодаря несложному оборудованию и небольшим затратам вещества точность определения молекулярного веса этим методом можно повысить. [c.167]

Определение молекулярного веса белков [c.168]

С точки зрения химии полимеров глобулярные белки обладают рядом необычных свойств как уже упоминалось, каждый белок характеризуется точным молекулярным весом. Структура таких макромолекул, вообще говоря, жесткая и довольно компактная. Удельная плотность у разных веществ этого типа одинакова и, следовательно, можно считать, что каждой единице молекулярного веса свойствен определенный объем а это является обязательной предпосылкой для определения молекулярного веса путем сравнения объемов исследуемых молекул с объемом молекул стандартных соединений. Поэтому некоторые авторы [58, 65], которые, количественно оценивая поведение белка при элюировании, пытались исходить из теоретических представлений, связывали радиусы по Стоксу с объемом выхода. Почти во всех рассмотренных выше работах, касающихся определения молекулярного веса с помощью гель-хроматографии, несколько настораживает тот факт, что установленные соотношения предполагают наличие у молекул белков симметричной (сферической) формы. Однако в действительности форма молекул нативных белков не настолько отличается от симметричной, чтобы это могло повлиять на разделение, основанное на различии в размерах. Лишь Зигель и Монти [66] описали два предельных случая, когда высокомолекулярные белки, имеющие небольшой радиус (по Стоксу), элюировались на сефадексе 0-200 после низкомолекулярных компонентов. Однако эти белки — фибриноген (мол. вес 330000), ферритин (мол. вес 1 300000) и уреаза (мол. вес 483 ООО) — еще настолько мало [c.169]

В конце главы (см . литературу, приложение IV) приведен ряд других р абот, касающихся определения молекулярного веса белков с помощью гель-хроматографии. Эти работы не были упомянуты в табл. 26, поскольку в них речь идет о плохо охарактеризованных ферментах или других белках. [c.175]

IV. Определение молекулярного веса белков методом гель-хроматографии [c.208]

Молекулярные веса белков. Методы, применяемые для определения молекулярного веса белков, аналогичны методам, применяемым в случае других макромолекулярных соединений (том I), но, разумеется, они приспособлены к специальным проблемам химии белков. [c.428]

При применении различных методов определения молекулярного веса к одному и тому же белку получаются, как правило, хорошо совпадающие величины (см. табл. 16). Это указывает на точность подобных методов. [c.430]

Все белки денатурируются под действием кислот или при нагревании, что проявляется в коагуляции и уменьЩенин растворимости, а также в потере специфических биологических свойств. Определение молекулярного веса белков является трудной задачей. Исходя из содержания железа в гемоглобине крупного рогатого скота, было найдено, что молекулярный вес этого белка лежит в пределах 16 000— 17 000. Молекулярный вес казеина, определенный по содержанию легко отщепляющейся серы, равен 16 000 и т. д. Подобные выводы, однако, справедливы лншь прн том условии, что данный белок однороден и содержит в своей молекуле только один атом того элемента, который используется для расчета молекулярного веса. Криоскопическое определение молекулярного веса затрудняется тем, что даже растворимые белки образуют коллоидные растворы наблюдаемое малое понижение точки плавления соответствует большому весу мицеллы. Более подходящими являются методы, основанные на определении скорости диффузии и вязкости. Помимо них практическое значение приобрел предложенный Сведбергом способ определения велич1п-1ы частиц по скорости седиментации в ультрацентрифуге. [c.396]

Коллоидные растворы нативных белков монодисперсны, т. е. обладают определенной величиной молекулярного веса. Точное определение молекулярного веса белков, сталкивается со значительными трудностями и поэтому величины молекулярного веса, находимые различными методами (осмотическое давление, диффузия, ультрацентрифугирование), часто не дают полного совпадения. Значения для молекулярного веса некоторых белков приведены в табл. 5 (см. приложение). [c.148]

НИЮ С обычным количеством метиленбисакриламида. Для этих белков, по-видимому, точность определения молекулярного веса, равная 10%, также достижима. [c.421]

Известны два основных метода деградации белковой молекулы — частичный кислотный гидролиз и ферментативный гидролиз. Первый метод менее селективен, по с его помощью могут быть получены ценные данные относительно структуры низкомолекулярных белков определенного молекулярного веса. Полный гидро.-лиз белков до составляющих аминокислот не позволяет установить последовательность расположения аминокислот в белке. Однако количественное определение соотношений отдельных аминокислотных, остатков дает возможность судить о гомогенности данного белка. На основе этих данных можно рассчитать эмпирические формулы и сравнить их с формулами, полученными нри помощи элементарного анализа. Это необходимо сделать до проведения частичного гидролиза белка или его ступенчатого расщепления для определения последовательности аминокислот. Подобная методика приведена в статьях Белла и сотр., посвященных определению структуры одного из физиологически активных компонентов кортикотронина [И, 25, 152, 153]. [c.392]

Белок, молекулы которого превышают размер пор, будет свободно проходить между гранулами и выходить первым из хроматографической колонки (рнс. 68). Вещества с меньшим молекулярным весом будут распределяться во внутреннем объеме гранул и растворителе, протекающем между ними, отставая при этом в движении. Путь, пройденный белком при определенных условиях, зависит от размеров молекулы, что позволяет использовать гель-хроматографпю (обычно в тонком слпе) для определения молекулярного веса по калибровочным кривым (рнс. 69). [c.172]

Число аминокислотных остатков, входящих в макромолекулы отдельных белков, весьма различно в инсулине их 51, в миоглобине — около 140, в белке ВТМ — свыше 300 тыс. Поэтому и молекулярный вес белков колеблется в очень широких пределах — от 10 ООО у. е. до нескольких миллионов. На основе определения молекулярного веса и элементарного анализа установлена эмпирическая формула белковой молекулы — гемоглобина крови — ( тзвНцооОаов 203 аРе) . [c.418]

По длине пептидных цепей гормоны гипофиза значительно различаются между собой. Некоторые из них относятся к белкам среднего молекулярного веса. Например, гормон роста человека имеет мол. вес. 21 500 и характеризуется высокой специфичностью гормоны роста из других источников не могут его заменять. Гормон, стимулирующий функцию щитовидной железы (тиреотропии, ТТГ), представляет собой гликопротеид с мол. весом 28 000. С другой стороны, гормоны нейрогипофиза (задней доли гипофиза) вазопрессии и окситоцин являются простыми пептидами, построенными всего лишь из 9 аминокислотных остатков (собственно, из восьми, если считать цистин одной аминокислотой рис. 2-2). Как указывает уже само название, нейрогипофиз состоит из нервной ткани, секреторная функция которой находится под непосредственным контролем центральной нервной системы. Вазопрессии является основным фактором, регулирующим объем циркулирующей крови и артериальное давление на уровень секреции этого гормона оказывает влияние стресс. Окситоцин действует на гладкие мышцы матки при родах, а также служит триггером лактации. Выделение молока из молочных желез в определенной мере зависит от сосательных движений младенца, под влиянием которых происходит рефлекторное высвобождение окситоцина в кровоток. [c.321]

В настоящее время имеется ряд новых методов определения молекулярного веса, которые могут соперничать с ультрацентрифугированием. Один из них — это простая гель-фильтрация. Колонку тщательно заполняют гелем (например, сефадексом) и калибруют, пропуская ряд белковых растворов. Измеряют Уе — объем элюата, собранного с момента нанесения вещества на колонку до момента его выхода из колонки, и делят этот объем на Уо — объем элюата для очень крупных частиц, совершенно не проникающих внутрь частиц геля. Далее строят зависимость Уе/Уо ОТ логарифма мол. веса для ряда белков с известным молекулярным весом. Как и при оценке молекулярных весов по константам седиментации, здесь предполагается, что молекулы всех белков имеют примерно сферическую форму для неизвестного белка значение молекулярного веса определяют по местоположению отвечающей ему точки на описанном выше графике [153, 154]. Модификацией этого метода служит хроматография при высоких концентрациях гуанидинхло-рида — соли, вызывающей денатурацию белков. Предполагается, что в таком растворителе белковая молекула представляет собой статистический клубок [154]. [c.182]

Тонкослойный вариант гель-фильтрации был предложен Детер-маном [6], а также Иоханссоном и Римо [11 ] и оказался весьма полезным для микроанализа и быстрого сравнительного анализа нескольких образцов исследуемого материала. Эндрюс [1 ], а позднее Моррис [12] применили тонкослойную гель-фильтрацию для определения молекулярного веса белков на основе установленной ими линейной зависимости между логарифмом молекулярного веса данного белка и расстоянием, пройденным им в слое данного носителя за определенный помежуток времени. В соответствии с этим можно ориентировочно определять молекулярные веса неизвестных белков, если одновременно проводить гель-фильтрацию стандартных белков известного молекулярного веса. Когда исследователь располагает достаточно чувствительными методами обнаружения белка в слое носителя, для определения молекулярного веса достаточно всего лишь нескольких микрограмм исследуемого материала. При определении молекулярного веса белков гель-фильтрацией в тонком слое следует иметь в виду, что подвижность данного белка при хроматографии в гель зависит не только от молекулярного веса, но и от формы его молекул. Поэтому определение молекулярного веса с помощью гель-хроматографии правомерно лишь в том случае, когда форма молекул исследуемого белка незначительно отличается от < рмы молекул стандартных белков, используемых для калибровки. [c.238]

В предыдущей главе рассмотрен один из классов коллоидных растворов — суспензоиды. Однако имеется больщое число коллоидных растворов иного типа, технически еще более важных и отличающихся совершенно другими свойствами. Они получаются обычно непосредственным растворением в соответствующих растворителях аморфных твердых веществ. Чтобы иметь полную характеристику этих растворов, необходимо прежде всего получить возможно более ясное представление о химической структуре тех аморфных веществ, из которых они получаются. Применение классических методов определения структуры химических соединений к таким аморфным веществам, как каучук, целлюлоза, белки и т. п., прежде считалось невозможным. Эти вещества трудно поддаются очистке от обычных осмотических методов определения их молек лярного веса пришлось отказаться, так как дпя этих веществ получались величины слишком высокие, что не допускало точности измерения наконец, никаких методов химического их синтеза не существовало. Прогресс последних лет в разрешении этих проблем был изумительный электродиализ, центрифугирование и др. улучшили методы очистки ультрацентрифугирование и изучение вязкости дали надежные методы определения молекулярного веса наконец, были разработаны непосредственные и относительно простые синтезы, если не подлинных природных продуктов, то весьма сходных с ними по свойствам. В рез5 льтате открылась новая многообещающая глава в изучении аморфных веществ. [c.150]

Уравнение (11-114) можно применять, например, для определения молекулярного веса белков. С помощью соответствующей методики, (см. разд. III-12) белок распределяется по поверхности в виде нерастворимой пленки, предположительно состоящей из нераззернутых молекул. При очень низких концентрациях эта система описывается законом двумерного идеального газа. Зная вес белка в пленке и площадь, которую она занимает, находят поверхностную плотность w/A. Далее измеряют давление в пленке п и по формуле [c.75]

Преимущества метода реплик состоят в том, что его можно применять ко всем высокомолекулярным соединениям, в том числе нерастворимым, и определение молекулярного веса производить также и на технических смесях, так как присутствие других ингредиентов обычно не мешает измерению. Реплики получают с поверхности излома замороженного полимера. Естественно считать, что межмолекулярные силы слабее, чем внутримолекулярные, представляющие собой силы химической связи. Поэтому образования, наблюдаемые на микрофотографиях реплик с поверхности излома полимеров, могут быть интерпретированы как одиночные макромолекулы или их агрегаты. Однако иногда бывает нелегко отличить молекулу от агрегата или от структурных неоднородностей материала, применяемого в качестве промежуточного отпечатка, что является недостатком метода реплик. Проще обстоит дело с исследованием биологических макромолекул, значительн5 ю часть которых составляют белки с очень большим молекулярным весом, часто равным нескольким миллионам. Помимо большой величины этих молекул, исследование облегчается также тем, что их можно получить в кристаллическом состоянии и периодичность структуры поверхности кристалла позволяет проводить более точную идентификацию. [c.252]

Изменения активности некоторых белков коррелируются, как правило, с изменениями ряда физических свойств. Так, изменение формы белковой молекулы можно установить по изменению некоторых гидродинамических характеристик (например, коэффициента трения, инкремента вязкости), по изменению светорассеяния, поверхностных свойств, диффузии через полупроницаемые мембраны и скорости седиментации [90]. Изменения термодинамических свойств (энтальпии и энтропии), объема, растворимости, оптического вращения, поглощения в инфракрасной области, дифракции электронов, а также некоторые другие характеристики, приведенные Каузманом [90], используются для Оцейки изменений формы белковых молекул. Большинство этих измерений было проведено па макромолекулах неизвестной структуры, для которых не была установлена последовательность аминокислотных остатков. В настоящее время благодаря усовершенствованию методов деградации белков, аналитического определения Концевых групп, методов разделения и идентификации отдельных фрагментов можно успешно изучать белки с молекулярным весом порядка 20 ООО. Хотя эта работа еще не достигла молекулярного уровня, тем не менее она дает возможность лучше использовать значения физических констант белковой молекулы известной структуры для объяснения механизма взаимодействия фермента с субстратом. Структура такого белка, как фиброин (белковое вещество натурального шелка), в настоящее время хорошо изучена благодаря сравнению рентгенограммы и ИК-спектров нативного волокна с рентгенограммами [35, 38, 108, 140] и ИК-спектрами [168] небольших фрагментов белка известной структуры, полученных при деградации, а также синтетитегаихпмшнептидо [c.386]

С-ЮО, сверхтон- кий 10X20 То же 0.5 Наклон 10—20° Промывают растворителем несколько часов 8—10 час На пластинке парами иода Определение молекулярного веса белков 189] [c.86]

Ранее уже отмечалось, что применение гель-хроматографии в тонком слое до сих пор ограничивалось разделением белков в водных буферных растворах. Исключение составляют отдельные эксперименты с пептидами [86, 87] и мукополисахаридами 93], а также попытки предварительной очистки рибонуклеоти-дов [94]. Однако есть все основания считать, что наряду с разделением на хроматографических колонках гель-хроматография в тонком слое найдет широкое применение в качестве микрометода и в этих областях. Количества образца, требующиеся для тонкослойной хроматографии, сравнительно малы, оборудование несложно. Метод позволяет за сравнительно короткий срок провести одновременно большое число опытов. Поэтому гель-хроматография в тонком слое особенно эффективна для определения молекулярного веса белков (см. стр. 153). Несколько меньшую (по сравнению с анализом на колонках) точность этого метода можно компенсировать статистической обра- [c.90]

В последние годы с помощью гель-хроматографии было очищено или выделено в чистом состоянии большое число ферментов. Конечно, этот новый метод ни в коей мере не может заменить традиционных методов очистки белков (например, осаждение растворителями или сульфатом аммония, а также ионообменную хроматографию). Однако гель-хроматография эффективно дополняет эти методы. Гели применяются главным образом для следующих целей I) удаление яизкомолекулярных примесей (гель-фильтрация, см. гл. IV) 2) отделение чужеродных белков на гелях соответствующей пористости (гель-хроматография) 3) определение молекулярных весов (см. табл. 26). В конце главы приведены работы (см. литературу, приложения I—III), в которых гель-хроматография явилась важным этапом при выделении фосфоэстераз и ряда других эстераз, а также дегидрогеназ, трансфераз и других ферментов. [c.212]

Итак, в ситовой хроматографии для хорошего разделения нужны достаточно длинные колонки. Вследствие того что коэффициент К не может превышать 1, при величине объема элюирования, равной у у колонке не остается вешества. Поэтому можно подобрать время ввода образцов таким образом, чтобы избежать частичного перекрывания предыдущей и последующей проб и разделять на одной колонке одновременно несколько образцов. Вначале в ситовой хроматографии чаще всего использовались водные растворы, а в качестве неподвижной фазы применялись сшитые декстраны. Когда эти гели набухают, они тановятся сравнительно мягкими. В основном разделение на декстранах проводили в стеклянных колонках при малой скорости потока растворителя. Гели главным образом применяют для разделения биохимических вешеств, а также для определения молекулярных весов. В последнем случае наибольший успех был достигнут при исследовании глобулярных белков. В данной главе основное внимание будет уделено разделению с помощью неводных растворителей Неподвижные фазы, используемые при работе с водными растворами, не могут применяться в случае органических растворителей, так как они не набухают и остаются непроницаемыми. Д р /2/ об- [c.109]

Подавляющее большинство высокомолекулярных белковых молекул состоит более чем из одной полипептидной цепи. Хотя ЭТИ белки при физиологических условиях ведут себя обычно как монодисперсные вещества с определенными молекулярными весами, фактически же они являются комплексами из нескольких полипептидных цепей, не связанных пептидными связями . Для этого феномена Бернал [13], расширяя терминологию Линдер-штрем-Ланга [12], предложил название четвертичная структура. [c.387]

Этот метод составил сильную конкуренцию другим общеизвестным методам, что объясняется прекрасной разрешающей способностью геля в широком диапазоне молекулярных весов, а также тем, что величина молекулярного веса может быть установлена простым способом в течение одного дня и с малым количеством белка, требуемым для анализа. Метод ультрацентрифугирования, например, теоретически разработанный очень полно, требует использования специального дорогостоящего оборудования. Недостатком этого метода является большая или меньшая точность определения удельного парциального объема. Неопределенность в 0,02 мл/г в этом параметре (т. е. 2—3%) вводит погрешность до 10% в величину рассчитываемого молекулярного веса, даже если все центрифужные измерения, необходимые для расчета, были проделаны точно. В диапазоне молекулярных весов от 15000 до 100 000 точность определения молекулярного веса при электрофорезе в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом лучше 10%. Этот диапазон легко перекрывается большим числом белков-стандартов, имеющихся в продаже. Трудность с более высокими молекулярными весами происходит, видимо, оттого, что в диапазоне от 90000 до 200000 имеется слишком мало стандартных белков. Молекулярные веса полипептидных цепей обычно не превышают 100 ООО. [c.421]