Ультрацентрифугирование седиментационного равновесия

При ультрацентрифугировании раствор исследуемого полимера помещают в кювету, закрепленную во вращающемся роторе. В зависимости от применяемого метода можно получить либо среднемассовое значение молекулярной массы (метод определения скорости седиментации при больших частотах вращения - метод скоростной седиментации), либо средневзвешенное значение (метод седиментационного равновесия, осуществляемый при меньших частотах вращения). Результаты измерения получают в виде кривых распределения по константам седиментации, по которым рассчитывают молекулярную массу. [c.176]

В седиментационном анализе можно проводить два типа экспериментов. При анализе методом скоростной седиментации проводят определения скорости оседания и диффузии частиц при бioльшиx скоростях вращения ротора, тогда как при анализе методом седиментационного равновесия выжидают установления равновесия между процессами седиментации и диффузии в процессе центрифугирования при меньших скоростях вращения ротора. Теоретически неоднородность распределения по молекулярным весам в образце можно охарактеризовать с помощью обоих указанных методов, получая методом скоростной седиментации распределение по коэффициентам седиментации, а методом седиментационного равновесия — распределение по молекулярным весам. Распределение по молекулярным весам легче интерпретировать хими-ку-полимерщику, не имеющему специальной подготовки. Было показано, что детализированный характер распределения по коэффициентам седиментации можно получить методом скоростной седиментации в отсутствие дополнительных предположений о форме кривой распределения. Такие дополнительные предположения, как правило, необходимы при анализе методом седиментационного равновесия. Скоростное ультрацентрифугирование приобрело, следовательно, наиболее широкое распространение при исследовании неоднородности распределения но молекулярным весам полученные этим методом данные обычно комбинируют с результатами других измерений, преобразуя кривую распределения по коэффициентам седиментации в кривую распределения по мол екулярным весам, в ряде случаев более подходящую для целей исследования. Метод седиментационного равновесия применяется в основном в качестве способа определения абсолютных величин средних молекулярных весов, но применение этого метода для растворов в смешанных растворителях ультрацентрифугирование в градиенте плотности), как недавно было показано, позволяет оценить распределение полимера по плотности. [c.216]

Ультрацентрифугирование используется для исследования процесса седиментации или седиментационного равновесия. В последнем случае требуется меньшая величина ускорения (скорость вращения порядка 10 об/с). Равновесное распределение концентраций описывается уравнением (3.30). Если в нем произвести замену [c.64]

Описанный выше способ разделения высокомолекулярных соединений и определения их молекулярных масс называется методом скорости седиментации, так как в его основе лежит различие скорости движения частиц, которая определяется массой частиц. Наряду с этим существует другой способ разделения с помощью ультрацентрифугирования, называемый методом седиментационного равновесия основанный на различии в распределении частиц с разной массой в поле тяжести или в центробежном поле в условиях равновесия. [c.335]

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров [1, 2, 4, 12] включает в себя три следующих экспериментальных метода скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) — ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца. Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) — молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения. Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это — широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей. [c.14]

Эти методы по сравнению с универсальными и играющими очень важную роль в биохимической практике методами аналитического гель-электрофореза имеют ограниченное применение, поэтому их описание будет кратким. Цель анализа конечного продукта, полученного в результате очистки, заключается в том, чтобы выяснить, содержит ли он один или большее число белков, и обнаружить в нем примеси, даже если они присутствуют в очень малых количествах. Гель-электрофорез позволяет выявить примесь какого-то одного компонента, составляющую 1% содержания основного компонента при условии их хорошего разделения. Однако бывают случаи, когда электрофорез не пригоден для исследования препарата. Это особенно относится к липопротеинам и другим связанным с мембранами белкам, которые при электрофорезе ведут себя необычно и нуждаются в определенных детергентах для поддержания их структурной целостности. В этих случаях, может быть, лучше использовать ультрацентрифугирование как основной или по крайней мере дополнительный метод, позволяющий получить информацию о гетерогенности данного препарата. В опытах по скоростной седиментации хорошо разделяются компоненты с сильно различающимися коэффициентами седиментации, однако если примесь по этому параметру сходна с основным компонентом и особенно если ее относительное количество слишком мало, то этот метод не дает надежных сведений о гетерогенности препарата. Метод седиментационного равновесия более пригоден для детектирования небольших количеств примеси по отклонению экспериментальных данных от теоретической прямой зависимости между логарифмом концентрации и квадратом расстояния от седиментирующей частицы до оси вращения. Однако это от- [c.330]

Остановимся на трех современных методах, с помощью которых с большей или меньшей полнотой решаются рассмотренные здесь задачи. Ультрацентрифуга позволяет развить еще один интересный метод, который сводится к измерению удельного объема полимера в растворе [25]. Идея его заключается в том, чтобы создать в кювете ультрацентрифуги градиент плотности. Это осуществляется выбором бинарного растворителя и притом такого, который составлен из более легкого и более тяжелого комнонентов (например, бензола и хлороформа). Ультрацентрифугирование приводит к быстрому (в течение 3—4 часов) установлению седиментационного равновесия в растворителе. Строго говоря, к этому случаю нельзя применить закон Больцмана, так как концентрации обоих компонентов одного порядка, т. е. раствор никак нельзя считать идеальным. Однако оценку величины разделения можно все же произвести по Больцману [c.168]

Классические косвенные методы определения размера частиц основаны на изучении адсорбции, скоростей растворения и седиментации, седиментационного равновесия, осмотического давления, рассеяния света, рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами, ультрацентрифугирования и явлений электрофореза [1]. Однако эти методы, как правило, дают возможность определить средний размер коллоидных частиц и нри попытках представить полученные данные в виде кривой распределения частиц по размерам возникают существенные затруднения. Заключения о форме частиц могут быть выведены на основании исследования рассеяния света и двойного лучепреломления в потоке, но и здесь установление распределения связано с математическими трудностями. [c.130]

Молекулярный вес продуктов диссоциации определяют как химическими (ср. разд. 10.2.3 и 10.2.4), так и физическими методами. Для установления молекулярного веса обычно используют методы ультрацентрифугирования (седиментация, диффузия, седиментационное равновесие [104, 105, ПО—115]), измерения светорассеяния [116—118] и осмотического давления [136. Характеристическая вязкость полимерных цепей в конформации статистического клубка связана простым соотношением с молекулярным весом. Следовательно, он может быть найден по измерению вязкости [137] (ср. разд. 10.2.7.5). Плотности и вязкости различных водных растворов представлены в табл. 2. Размер полипептидных цепей при денатурации можно оценить пО полипептидам-маркерам с известными молекулярными весами при электрофорезе в полиакриламидном геле (ср. разд. 10.2.7.4) и гель-фильтрации (ср. разд. 10.2.7.5). [c.414]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

Делаются попытки найти другие параметры для характеристики полидисперсности. Например, часто используют реологические кривые течения, а также данные по седиментационному равновесию, получаемые при ультрацентрифугировании. Однако все эти параметры каждый раз следует сопоставлять с кривыми распределения, так как они не дают возможности судить о детальных особенностях фракционного состава вещества. Более подробно данный вопрос рассмотрен в ряде работ [c.46]

Седиментация макромолекул (ультрацентрифугирование). Константа седиментации. Седиментационное равновесие. Определение молекулярных масс методами ультрацентрифугирования. [c.382]

Существует три основных метода определения молекулярных весов при помощи аналитического ультрацентрифугирования определение скорости седиментации, метод седиментационного равновесия и метод приближения к седиментационному равновесию. [c.61]

Метод седиментационного равновесия. Определение молекулярных весов этим методом проводится при сравнительно небольших скоростях вращения ротора, порядка 7 ООО—8 000 об-мин , чтобы молекулы с большим молекулярным весом не осаждались на дно. Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных — с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества согласно формуле [c.62]

Исследуемый раствор белка помещают в небольшую прозрачную для световых лучей ячейку, которую вставляют в специальное гнездо ротора. Молекулы белка в этой ячейке под действием центробежной силы, развиваемой при вращении ротора, постепенно оседают на дно. Фотоприставка к ультрацентрифуге позволяет делать снимки содержимого ячейки через определенные промежутки времени и определять таким образом скорость оседания белковых частиц. Определение молекулярной массы белка методом ультрацентрифугирования ведут двумя способами по скорости седиментации белковых молекул и по седиментационному равновесию. [c.36]

В принципе при ультрацентрифугировании всегда происходит одно и то же частицы движутся под действием центробежной силы, и их концентрационное распределение по длине центрифужной пробирки определяют через какое-либо время или через промежутки времени. Измерение движения молекул вдоль направления действия центробежной силы называется определена-ем скорости седиментации, в результате чего получается коэффициент седиментации, значение которого дает информацию о молекулярной массе и форме частицы. Когда распределения концентрации измеряются при таких условиях, при которых распределение не изменяется во времени, говорят, что частицы достигли седиментационного равновесия эти данные дают сведения о молекулярной массе, плотности и составе. [c.275]

Этот метод, впервые предложенный Ламмом [1, 2], является наиболее точным из всех рефрактометрических методов определения градиентов концентрации, но связан с довольно кропотливой обработкой фотопластинок. Применение его поэтому стремятся ограничить теми случаями, когда первостепенное значение приобретает воспроизведение кривой распределения концентрации во всех деталях. Обычно это имеет место при измерениях коэффициентов диффузии полидисперсных веществ и при исследовании в ультрацентрифуге молекулярно-весовых распределений (скоростным ультрацентрифугированием или методом седиментационного равновесия) [4, 5]. [c.271]

Кональбумин и лактоферрин изучены в меньшей степени, чем трансферрин. Наиболее точная оценка молекулярной массы кональбумина, определенная по его способности связывать железо, дала значение около 76 000 дальтон [42]. Методом седиментационного равновесия для коровьего лактоферрина получена молекулярная масса 77 100 [29], для лактоферрина человека исследованием связывания железа получено значение 80 000 [43], а методом определения скорости седиментации при ультрацентрифугировании [И] — значения 95 000 [11] и 82 000 [14]. [c.337]

При измерении средневесового молекулярного веса обычно пользуются методом светорассеяния, седиментационного равновесия, ультрацентрифугирования и в некоторых случаях вискозиметри- [c.16]

Если не считать предварительных работ, проведенных с медноаммиачными растворами целлюлозы [100], то первое точное исследование линейных высокополимеров методом ультрацентрифугирования было проведено на кристаллической, хорошо фракцио-нированнор поли-ш-оксидекановой кислоте Кремером и Лансингом в 1932 г. [101]. Седиментационное равновесие, скорость седиментации и диффузия раствора этого веш,ества в тетрабромэтане в низкоскоростной ультрацентрифуге дали средневесовой молекулярный вес 27 ООО в хорошем соответствии со среднечисленным молекулярным весом 25 200, определенным титрованием конечной карбоксильной группы. Считая реальным это различие молекулярных весов, можно принять, что коэффициент неоднородностн р фракции был равен приблизительно 0,4. [c.552]

Изложенный материал показывает, что ультрацентрифугирование является одним из основных методов исследований в области белков и вирусов. Примеры, взятые из об.1асти высокополимеров, подтверждают, что методы ультрацентрифугирования займут и здесь видное место. Однако при изучении высокополимеров еще 6o.iee, чем при исследовании белков, необходимо использовать все существующие методы, изучая осмотическое давление, рассеяние света, седиментационное равновесие, скорость седиментации, диффракцию и рассеяние рентгеновских лучей нод малыми углами, двупреломление при течении, диффузию и вязкость. Данные, полученные всеми перечисленными методами, [c.561]

Болдуин [46] и Гехатиа [135] описали методы вычисления коэффициента диффузии из данных по скорости седиментации, в которых, однако, не учтена зависимость 8 от с. Недавно был предложен другой метод, подобный методу Болдуина, но более простой по вычислениям [1361. Точность всех этих методов, вообще говоря, невелика. Следует отдать предпочтение методу Арчибальда, дающему 1М и 5, из которых в случае необходимости можно вычислить О. В 1958 г. было предложено два других способа определения О из данных ультрацентрифугирования [137, 138]. Оба метода основаны на наблюдении скорости достижения седиментационного равновесия. Здесь также необходимо отсутствие межмолекулярного взаимодействия, поэтому требуется экстраполяция получаемых данных к нулевой концентрации. Этот метод применим к веществам с относительно низким молекулярным весом его использование может быть удобным в тех случаях, когда желательно из одной серии экспериментов по седиментационному равновесию получить одновременно М и Д. Модификация уравнения Назариана [1381 была успешно применена для определения коэффициента диффузии лизоцима [ИЗ]. [c.62]

Паркер и сотр. [72] в предварительных опытах показали, что восстановление и алкилирование дисульфидных связей в трансферрине по методу Крестфилда и сотр. [73] не вызывают диссоциации трансферрина на субъединицы. Это было доказано с помощью ультрацентрифугирования, методом седиментационного равновесия, с помощью гель-фильтрации на сефадексе Г-75, а также методом электрофореза на крахмальном геле в различных буферных системах (формиатный буфер pH 2,8, фосфатно-цитратный буфер pH 5,6 и боратный буфер pH 9,0) в присутствии мочевины. Кроме того, при определении N-концевых аминокислот в трансферрине динитрофениль-ным методом Сэнджера [74] и цианатным методом Старка и Смита [75] был обнаружен только один остаток валина при расчете на молекулярный вес 83 ООО, что согласуется с ранее опубликованной величиной молекулярного веса [76, 76а]. На основании описанных данных молекулу трансферрина можно представить в виде одной полипептидной цепи, содержащей примерно 750 аминокислот, и, следовательно, трансферрин является самым крупным из белков плазмы, который не был диссоциирован на субъединицы. [c.128]

Определение молекулярных масс осмотические методы - теория - среднечисловая молекулярная масса — экспериментальные методы — светорассеяние - средневесовая молекулярная масса — ультрацентрифугирование -кянстанты диффузии - седиментационное равновесие - характеристические вязкости - молекулярно-массовые характеристики - средневязкостная молекулярная масса и полидисперсность - ИК и ЯМР полимеров -гель-фильтрационная хроматография. [c.378]

Образно говоря, белки являются липкими и стремятся связаться друг с другом. Силы, обеспечивающие эту липкость , имеют различную природу. Это ионные связи, вандерваальсовы взаимодействия, водородные связи и т. д. Такое поведение белков может очень сильно влиять на их седиментационные свойства. Наиболее важен в связи с этим кинетический подход. Если скорость взаимодействия между компонентами невелика, то при ультрацентрифугировании можно наблюдать одновременно каждый компонент. Если же равновесие между компонентами смеси устанавливается быстро по сравнению с временем центрифугирования, то могут образовываться седиментирующие формы с промежуточными свойствами. Рассмотрим, например, чистый белок. При электрофорезе он ведет себя как один компонент, несмотря на наличие большого количества его ионных форм, очень быстро переходящих друг в друга. Кенн и Гоуд [9], однако, описали условия, в которых чистый белок не обязательно дает одну зону. [c.156]

По ранним представлениям, в случаях, когда равновесие устанавливается быстрее, чем общая длительность ультрацентрифугирования, такая система, как пА должна давать один пик со свойствами, промежуточными между свойствами мономера и полимера. Система А В - -С должна давать два шлирен-пика, поскольку, если считать, что скорость седиментации этих компонентов падает в последовательности А, В, С, медленный пик будет соответствовать легкой молекуле С, в то время как вторая (быстрая) граница благодаря присутствию В будет отвечать также движению некоторого количества образующегося тяжелого компонента А. На деле, однако, все обстоит значительно сложнее. При седиментационном исследовании а-химотрипсина при визкой ионной силе и pH 7,9 Мэсси, Харрингтон и Хартли [11] получили странные результаты, не укладывающиеся в описанную выше простую схему. Теоретическое объяснение этих результатов было предложено Джил-бертом [12], впоследствии более подробно разработавшим свой подход к решению трудной задачи об обратимых системах, из которых центробежное поле постоянно забирает тяжелые компоненты [13, 14]. Джилберту удалось объяснить результаты Мэсси и сотрудников, исходя из системы с одним пиком для димеров и из системы с двумя пиками для гексамеров. Он вычислил долю гексамеров, совпадающую с экспериментальными данными, и точно предсказал значение 5 как функцию концентраций обоих компонентов. В своих рассуждениях [c.157]

Недавно Смит и Браун [1536] исследовали седиментацию трех приготовленных Янсеном и сотрудниками [8, 26, 141] кристаллических производных а-химотрипсина, а именно 1) фермента, ингибированного при помощи ДФФ, 2) активного окисленного фермента и 3) окисленного фермента, ингибированного обработкой ДФФ. Ранее проведенные седиментационные исследования показали, что а-химотрипсин в отличие от зимогена ведет себя как смесь мономера и димера. Исследование указанных производных было предпринято с целью определить природу детерминирующих групп. Для ДФФ-производного а-химотрипсина и активного окисленного фермента при ультрацентрифугировании были получены диаграммы, характерные для равновесия мономер — димер в необработанном ферменте. Однако после повторной обработки с помощью ДФФ и окисления получается производное, которое осаждается при рН 4,0 как мономер. Отсюда был сделан вывод, согласно которому в димеризации а-химотрипсина принимают участие несколько групп, одна из которых должна иметь ионный характер, так как указанное явление зависит от величины рН. Седиментация аналогичных производных трипсина имеет совершенно иной характер [153 в]. При ограниченной концентрации активного трипсина последний ведет себя во время седиментации подобно активному химотрипсину и ДФФ-производному а-химотрипсина, т. е. обнаруживает характерную обратимую агрегацию, зависящую от концентрации и от величины рН. Однако ДФФ-производное трипсина, так же как и трипсиноген [153г], осаждается в подобных условиях в виде мономерных частиц. [c.344]

Под методами ультрацентрифугирования имеют в виду 1) метод скорости седиментации, позволяющий определять константы седиментации, и 2) метод седимент-ациоиного равновесия между седиментацией и диффузией, являющийся одним из немногих абсолютных методов определения молекулярных весов. Седи-ментационно-равновесная центрифуга может дать надежные данные относительно средних молекулярных весов и распределения молекулярных весов. Седиментационно-скоростная центрифуга с большим числом оборотов позволяет с уверенностью определять гель-фракцию, дает наиболее полные сведения относительно распределения частиц но размерам и формы частиц в растворе. Удлиненная форма большинства высокополимерных молекул, за исключением белков, до последнего времени значительно затрудняла изучение распределения размеров частиц по данным скорости седиментации, но за последние годы были достигнуты значительные успехи главным образом благодаря работам Гралейна и Юландера (стр. 471). [c.462]

Известны три метода ультрацентрифугирования, нр№ меняемых для определения молекулярного веса метод ско рости седиментации, метод седиментационного paвнoвe иi и метод приближения к равновесию или метод Арчибаль да [171]. [c.22]