Стабилизация ферментов субстратами

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макро-молекулярным субстратам), зависимости каталитической активности от pH, ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям. Отметим, что крупный вклад в разработку общих принципов стабилизации ферментов был сделан советскими исследователями. [c.7]

Очищенные ферментные препараты хранят при низкой температуре (до -80 °С). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для промышленного применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды (глюкоза, сахароза, лактоза), HS- o-единения (цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, дитиотреитол и др.), отдельные аминокислоты, желатину и другие белки-наполнители. [c.84]

Гидрофобное взаимодействие имеет большое значение для образования мицелл и стабилизации определенных конформаций полипептидов и протеинов в водном растворе, а также играет, вероятно, важную роль при образовании биохимических комплексов фермент-субстрат [49]. [c.24]

Электростатические взаимодействия вносят вклад в специфичность трипсина к остаткам Lys и Arg. Трипсин [244, 245, 536] связывает свои субстраты существенно тем же способом, что и химотрипсин. Однако трипсин специфичен к положительно заряженным остаткам субстрата боковая цепь Lys или Arg электростатически связывается с остатком аспарагиновой кислоты на дне связывающего кармана фермента. Кристаллографические исследования комплексов трипсина и белковых ингибиторов трипсина [269, 632] показали, что способ связывания очень сходен с образованием комплекса сериновая протеаза — субстрат. Очевидно, ингибитор точно-воспроизводит субстрат. Механизм, ведущий к расщеплению субстрата трипсином и к стабилизации комплекса трипсин — ингибитор-[269, 536], рассматривается в разд. 11.2. [c.248]

Электростатическое взаимодействие фермент — субстрат. Боковые группы Н субстратной молекулы могут взаимодействовать с белком Е электростатически (при наличии противоположно заряженных групп в реагирующих частицах). Электростатическая стабилизация переход- [c.45]

Гидрофобные взаимодействия возникают в белке, находящемся в состоянии клубка. В том случае, когда большинство связей, стабилизующих вторичную структуру, разорвано, даже малое число гидрофобных взаимодействий играет решающую роль в стабилизации конформации. Нужно еще отметить, что наличие гидрофобных групп в белковой молекуле, вполне возможно, является не только фактором, стабилизирующим нативную пространственную структуру, но и имеет непосредственное значение для каталитического акта. Как подчеркнул Перутц [87], неполярная среда с низкой диэлектрической проницаемостью, возможно, усиливает электростатические взаимодействия субстрата с полярными группами фермента, увеличивая тем самым скорость химических реакций. В работах Березина и Мартинека с сотр. [88] обнаружено, что гидрофобным взаимодействиям принадлежит главная роль при связывании конкурентных ингибиторов а-химо-трипсином. [c.19]

Говоря о тепловой денатурации, важно обратить внимание на возможность протеолиза. Протеазы, как и другие ферменты, активируются при повышении температуры. Они обычно довольно стабильны, так что даже в том случае, когда нужный фермент сохраняет активность, вполне может произойти частичное расщепление белка или его небольшая модификация, что неблагоприятно скажется на качестве препарата. Именно по этой причине предпочтительно проводить нагревание в присутствии сульфата аммония (несмотря на то что под влиянием соли белки могут стабилизироваться настолько, что для их денатурации потребуется более высокая температура), поскольку высокие концентрации соли в значительной мере ингибируют протеолиз. Есть также примеры стабилизации фермента его субстратом, однако присутствие субстрата может также и дестабилизировать фермент. [c.86]

При этом должен наблюдаться эффект стабилизации фермента при низких концентрациях субстрата. При насыщении фермента [c.112]

Используя предыдущие соображения, можно теперь легко объяснить ферментативный катализ соединение субстрата с активным центром увеличивает частоту возникновения редких переходных состояний. С этой точки зрения можно считать, что активный центр р-галактозидазы имеет предпочтительное сродство к молекулам лактозы, находящимся в переходном состоянии. Следовательно, р-галактозидаза лолжна выбирать из раствора редко встречающиеся молекулы лактозы, находящиеся в гидролитическом переходном состоянии, и держать их в этой реакционноспособной форме в течение гораздо большего времени, чем они могут существовать в этом состоянии в свободном растворе. Теперь проанализируем, что означает число оборотов, равное для Р-галактозидазы 4000 молекул лактозы на 1 молекулу фермента за 1 с. Это число означает, что если молекула лактозы в переходном состоянии уже выбрана активным центром фермента, то в среднем пройдет 1/4000 с до того, как эта молекула будет гидролизована на галактозу и глюкозу. Переходное состояние фигурирует также и в обратной реакции, которая заключается в образовании лактозы из глюкозы и галактозы. Поэтому избирательная стабилизация ферментом этого переходного состояния ускоряет также и обратную реакцию. В результате, как уже говорилось, присутствие фермента не влияет на состояние равновесия реакции гидролиза. [c.107]

Голубые медьсодержащие оксидазы являются необычными катализаторами в том отношения, что они могут восстанавливать оба атома молекулярного кислорода до Н2О. Этим они напоминают цитохромоксидазу (которая также содержит медь разд. Б, 5), но они не содержат железа. Оксидаза аскорбиновой кислоты из растительных тканей превращает аскорбат в дегидроаскорбат (дополнение 10-Ж). При добавлении к этому ферменту субстрата голубой цвет фермента блекнет, и можно показать, что медь в этом случае восстанавливается в (-1-1) "Состояние. Лакказа из сока японского лакового дерева или из гриба Polyporus катализирует такое же превраще-ни субстратов, как и тирозиназа, но продуктом вместо перекиси водорода является Н2О. У фермента из Polyporus, который в отличие от тирозиназы нечувствителен к СО, молярная экстинкция при 610 нм >1000. Было показано, что лакказа содержит но меньшей мере три типа ионов меди. Один имеет голубой цвет, как у молекулы типа азурина, и связывает кислород. Другой ион меди не имеет голубого цвета и, вероятно, служит центром связывания анионов — возможно, это необходимо для стабилизации образующейся на промежуточной стадии перекиси. Два других иона Си + образуют диамагнитную пару, которая служит двухэлектронным акцептором, получающим электроны от субстрата и затем передающим их на кислород, очевидно, с промежуточным образованием перекиси. [c.448]

При этом должен наблюдаться эффект стабилизации фермента при низких концентрациях субстрата. При насыщении фермента субстратом ( 5), >> А , ) эффективная константа скорости инактивации выходит на предельное значение, определяемое константой скорости инактивации фермент-субстратного промежуточного соединения (рис. 2.97). [c.252]

У простых ферментов каталитическую функцию осуществляют непосредственно белки. В реакции с субстратом принимает участие не вся полипептидная цепь, а всего лишь несколько аминокислотных остатков, как правило, расположенных на значительном удалении друг от друга в полипептидной цепи. В процессе формирования третичной структуры происходит их сближение и стабилизация при помощи дисульфидных или множественных слабых связей. Денатурация нарушает связи, стабилизирующие третичную структуру, активный центр разрушается, и каталитические свойства фермента полностью или частично подавляются. [c.64]

Для интенсификации брожения применяют также рециркуляцию биомассы дрожжей или сбраживаемой среды из третьего и четвертого бродильных аппаратов в первый. Это позволяет повысить концентрацию дрожжевых клеток в рециркуляционном контуре и увеличить скорость разбавления в нем. Рециркуляцией сбраживаемой среды и биомассы дрожжей достигается стабилизация технологических показателей и осахаривания, так как при этом увеличиваются поверхность контакта дрожжей и обрабатываемого сусла, а также контакт между ферментами осахаривающих материалов и субстратом. Рециркуляцией достигается совмещение лаг-фазы и экспоненциальной фазы роста дрожжей, что ведет к сокращению продолжительности брожения. Особенно резко сокращаются периоды возбраживания и добра-живания, и за этот счет увеличивается период главного брожения. [c.106]

Молекулы белков не являются жесткими структурами — они подвижны л, следовательно, достаточная лабильность молекул ферментов (молекулярная вибрация) играет важную роль в узнавании субстрата и стабилизации переходного состояния [c.71]

Способы второго типа следующие а) влияние многоатомных спиртов (типа глицерина и т. п.) в) влияние углеводов, моно- и дисахаридов, а также некоторых полисахаридов в) влияние неорганических электролитов, ионов минеральных солей г) специфическое действие некоторых ионов металлов (Са +, и др.) д) действие одних белков на другие, в том числе на ферментные белки е) действие нуклеиновых кислот ж) действие солей жирных кислот, детергентов и иных органических длинноцепочечных ионов в малых концентрациях з) действие некоторых кислых красителей и) влияние определенных видов химических модификаций, которые могут приводить к повышению устойчивости макроструктуры. К этому типу относятся еще четыре способа стабилизации, характерные для ферментов и связанные с воздействием на их активный центр. Это влияние субстратов, продуктов реакции, коферментов, простетических групп, специфических ингибиторов ферментов. [c.163]

Представление о химических особенностях участка, связывающего ацетилхолин, позволит нам судить о возможном влиянии температуры на сродство ацетилхолинэстеразы к ее субстрату, Прежде всего, поскольку слабые связи, стабилизирующие фермент-субстратный комплекс, чувствительны к температуре, изменения последней могли бы затруднять или облегчать стабилизацию этого комплекса даже при отсутствии каких-либо термически обусловленных изменений в структуре фермента. [c.262]

Молекулярная основа отрицательной температурной модуляции ферментов остается неизвестной. Однако в случае ацетилхолинэстеразы можно выдвинуть веские теоретические соображения, связанные с ролью гидрофобных взаимодействий в стабилизации комплекса фермент — ацетилхолин (рис. 81). Так как при снижении температуры примерно от комнатной температуры до 0°С гидрофобные взаимодействия ослабевают, есть основания полагать, что для того или иного варианта ацетилхолинэстеразы сушествует критическая температура, при которой ослабление гидрофобных связей между ферментом и субстратом приводит к резкому подъему кажущейся величины Км для субстрата. [c.275]

Возможно, каталитическая активность фермента отражает тонкий баланс между этими двумя экстремальными случаями. Свободный промежуточный ион карбония должен был бы иметь слишком высокую энергию, и это ограничивало бы протекание катализируемой реакции с необходимой скоростью, в то время как образование полной ковалентной связи с карбоксильной группой приводило бы к образованию промежуточного соединения, слишком стабильного, чтобы претерпевать быстрый завершающий гидролиз. Регулируя с высокой точностью расстояние и ориентацию между этой карбоксилатной группой и связанным субстратом, фермент реализует сразу две цели — ставит в тупик любого ученого, который хотел бы разложить механизмы всех реакций по четким категориям и достигает строгого баланса между активацией и стабилизацией, который необходим для эффективного катализа. [c.184]

Находящийся в клетке ингибитор связывается с конформером А и при достаточно высокой концентрации переводит весь фермент в неактивную форму А. Фермент оказывается выключенным или по крайней мере обладает очень низкой активностью. Прн высоких же концентрациях активатора фермент будет включен за счет стабилизации конформации В. Доля молекул фермента, находящихся в активной форме В, определяется концентрацией ингибитора, активатора и субстрата в клетке в данный момент времени. Подобное соотношение между ингибированием и активацией лежит в основе многих явлени11 регуляции клеточного метаболизма (гл. 1, разд. Е). [c.36]

Детальные исследования механизмов многих ферментативных реакций привели к установлению еще одной важнейшей причины их предельно высоких скоростей. Этой причиной является стабилизация переходных состояний (ПС) этих реакций. В стабилизацию ПС большой вклад вносит гидрофобное взаимодействие системы фермент—субстрат, которое возникает между углеводородными остатками фермента и субстрата. Чем больше длина К, тем выше скорость реакции. Скорость минимальна для -СН3 и -С2Н5 и максимальна у -СаНп- [c.727]

Очевидно, что структурные, спектроскопические и химические исследования не позволяют выявить аминокислотные остатки, ответственные за стабилизацию молекулы СОг при гидратации или аниона НСО"з в реакции дегидратации. Выяснение природы электронных перестроек, которые происходят в реакции карбоангидразы, представляет собой важную задачу дальнейших исследований этого фермента. Эдсал [245] отмечает, что причина, по которой неферментативная реакция гидратации СОг протекает значительно медленнее, чем реакция, катализируемая ферментом, заключается в том, что молекула СОг должна претерпевать значительную электронную перестройку при переходе из формы симметричной линейной молекулы с длиной связи С=0 116 пм к треугольному аниону НСОз с неэквивалентными связями С—О и с различными углами связей О —С —О. Структурные и спектроскопические исследования позволяют выяснить химическую природу некоторых групп в области активного центра, вовлекаемых в ферментативный катализ. Определение структурных основ стабилизации молекул субстратов СОг и НСОз" и промотирования ферментом электронной перестройки субстратов остается первостепенной задачей будущих исследований. [c.112]

Здесь стоит, пожалуй, несколько уклониться в сторону и рассмотреть вопрос о том, почему у растений не выработались РуДФ-карбоксилазы, более эффективно связывающие субстрат (СОг). На этот счет мы можем только строить гипотезы, опираясь на некоторые факты. Сам по себе субстрат обладает рядом особенностей, по-видимому, не слишком благоприятных для его эффективного связывания. Во-первых, его молекула мала и не обладает развитой стереохимической структурой поэтому у нее очень мало групп, способных взаимодействовать с поверхностью фермента. Во-вторых, она лишена электрического заряда. А поскольку при фермеит-субстратных взаимодействиях заряд играет обычно важную роль, фермент опять-таки ограничен в своих возможностях притянуть к себе молекулу СОг и удерживать ее у своей поверхности. Действительно, в других реакциях карбоксилирования (например,в реакциях пируваткарбоксилазы или ацетил-КоА — карбоксилазы) каталитически активным и предпочитаемым субстратом служит не СОг, а НСОГ по-видимому, заряд молекулы является необходимым добавочным источником энергии для стабилизации фермент-субстратного комплекса. [c.105]

Leu, не влияя Н8 снижает активность г5олее, чем в 200 раз. Авторы [2122] рассматривают этот факт, как подтверждение гипотезы стабилизации ферментом переходного состояния субстрата (см. гл.7 и 8). [c.199]

Предложено много гипотез, касающихся роли ионов металла в ферментативных реакциях. Не рассматривая эти гипотезы подробно, отметим основные общие положения 1) металл способствует связыванию субстрата с ферментом и входит в состав активного центра 2) комплекс металла с субстратом является фактически активированным субстратом и 3) образование комплекса между металлом и функциональными группами белка способствует поддержанию третичной структуры белка в конформации, необходимой для выполнения каталитической функции. Клотц [187], основываясь на данных об участии ионов металлов в связывании ииркдпн-2-азо-л-диметиланилина сывороточным альбумином быка, предположил, что для пептидаз, требующих наличия нона Мп(П) — слабого комплексообразователя, роль иона металла состоит не в связывании субстрата в основном состоянии. Он полагал, что один из возможных механизмов катализа включает стабилизацию промежуточного тетраэдрического соединения по следующему механизму [c.125]

При исследовании растворимой митохондриальной Н+АТФазы из сердца быка (фактор Fi) как в сопряженной регенерирующей системе, содержащей пируваткиназу с ее субстратом фосфоенолпируватом + лактатдегидрогеназа (рис. 2 А, В), так и в системе с рН-индикатором нейтральный красный (рис. 2 Б, Г) (уд. активность соответственно 50 ед./мг и 20 ед./мг) было установлено, что коэффициент седиментации активного фермента (12,4+0.4 5) с точностью до ошибки измерений совпадает с данными, которые получаются при обычной скоростной седиментации в отсутствие субстрата Mg-АТФ. По-видимому, этот фермент не изменяет своей общей конфигурации при гидролизе АТФ. В ходе этой работы было обнаружено, что гидростатическое давление в ячейке ультрацентрифуги инактивирует F , причем тем скорее, чем выше скорость вращения ротора (измерения проводили при 48000, 60 000 и 68 000 об/мин). Инактивация приводила к искривлению графиков Inr(t), из наклона которых вычисляется s, и это вынудило искать пути к стабилизации фермента. Измерения удалось произвести в двух вариантах. 1. Фактор Fi был обработан бифункциональным сшивающим агентом — диметилсуберимидатом — в условиях, когда в среднем на молекулу фермента приходилась одна сшивка при этом сохранялось около 40% активности и исчезала чувствительность к давлению (по крайней мере до 300 атм). [c.186]

Каталитическую активность а-химотрипсина нельзя приписать исключительно наличию системы переноса зарядов. Из рентгено структурных исследований следуют многие другие факторы, от ветственные за каталитический процесс. Было обнаружено де вять видов специфических ферментсубстратных взаимодействий которые повышают эффективность а-химотрипсина. Например стабилизация тетраэдрического интермедиата, а следовательно понижение энергетического барьера переходного состояния, со провождается образованием водородной связи между карбониль ной группой субстрата и амидным атомом Ser-195 и Gly-193 В химотрипсиногене эта водородная связь отсутствует. Действи тельно, уточнение структур химотрипсиногена и а-химотрипсина с помощью рентгеноструктурного анализа показывает различия в расположении каталитической триады в зимогене и ферменте. Это конформационное изменение в общей трехмерной структуре фермента, возможно, вызывает значительные изменения химических свойств каталитического центра, что может играть важную роль в увеличении ферментативной активности при активации зимогена. [c.221]

В любом случае трудно провести четкое разграничение между стабилизацией иоиа карбония близко расположенной карбокси-латной группой, как для карбокатиониого механизма, и образованием ковалентной связи между ними, как ири нуклеофильном катализе ([79], с. 184). Возможно, каталитическая активность фермента отражает тонкий баланс между этими двумя экстремальными случаями. По образному выражению Джейкса [79], фермент, регулируя с высокой точностью расстояние между кар-боксилатной группой и связанным субстратом, реализует сразу [c.177]

Факторы, приводящие к стабилизации переходного состояния (т. е. к уменьшению АО ), повышают скорость реакции. Вообще говоря, роль катализатора именно в том и состоит, чтобы способствовать образованию переходного состояния, обладающего меньшей энергией (более стабильного), чем переходное состояние для 1некатализируемой реакции. Стабилизация переходного состояния реакции ферментом означает, что фермент проявляет более высокое сродство к переходному состоянию, чем к субстрату или продуктам. Эта идея была впервые сформулирована Полингом [48] Я думаю, что ферменты шредставляют собой молекулы, которые комплементарны по структуре активированным комплексам, образующимся в ходе реакций, которые они катализируют. Притягивание астивирова,иного комплекса молекулой фермента должно, таким образом, приводить к уменьшению его энергии и, следовательно, к уменьшению энергии активации реакции и повышению ее скорости . [c.49]

НОМ центре фермента в положение, оптимальное для реакции, стабилизация преобразуемых в субстрате групп относительно их переходного состояния и кислотно-основный катализ. Необходимая для увеличения скорости энергия, по-видимому, черпается из свободной энергии образования фермент-субстратных комплексов. [c.292]

Особенно велики энергии переноса бензольной группы С НзСНг-, которая сильно ускоряет реакцию, если входит в состав субстратов. Энергия стабилизации за счет этого фактора доходит до 30 кДж/моль. Другой фактор стабилизации переходного состояния ферментативной реакции определяется электростатическим взаимодействием противоположно заряженных функциональных хрупп активного фермента и субстрата. Наблюдаемые значения [c.727]

Большое значение для эффектианости действия фермента может иметь сопряженный кислотно-осноаный катализ, а также нуклео-фильный катализ с образованием реакционноспособного промежуточного соединения- Немалую роль играет и фактор микросреды. Совокупность факторов, вносящих вклад а повышение каталитической активности ферментов, обеспечивает снижение энергетического барьера реакции. Согласно получившей весьма широкое признание концепции, снижение энергетического барьера достигается благодаря стабилизации переходного состояния или, точнее, благодаря приближению структуры субстрата а фермент-субстратном комплексе к структуре переходного состояния. Приближение к структуре переходного состояния требует в общем случае затраты энергии согласно рассматриваемой концепции, необходимая энергия обеспечивается за счет части энергии связывания субстрата с ферментом. [c.188]

Гипотеза, сформулированная Полингом [241 ], о природе переходного состояния фермент-субстратных комплексов утверждает, что функция ферментов определяется их способностью к более прочному связыванию форм переходного состояния, чем молекулы субстрата, и что это свойство обусловливает понижение свободной энергии активации реакции. На основании структурных исследований Липскомба и сотр. [29, 188, 189], свидетельствующих о координации карбонильного кислорода субстрата катионом металла, можно предполагать, что такой же способ координации существует в переходных фермент-субстратных коплексах металлсодержащих аналогов КПА. Следовательно, прочность связи металл— кислород, образующейся при присоединении субстрата, может давать существенный вклад в стабилизацию переходного фермент- [c.96]

ДОЛЖНО происходить за счет тех же множестьенных сил, которые ответственны за стабилизацию третичной и четвертичной структуры белков. И лишь для субстратов значительно меньшего молекулярного веса могут оказаться успешными попытки оценить индивидуальные силы связывания в чистом виде . Связывание белками различных небольших молекул, например неорганических ионов и некоторых ароматических структур, изучалось совершенно независимо от развития проблем ферментативного катализа. Но при этом были получены результаты, имеющие важнейшее значение для понимания механизма образования фермент-субстратных комплексов. [c.57]

Известно большое число разнообразных гидролитических ферментов (группа сериновые протеазы - трипсин, химотрипсин и т.п. ферменты, гиролизующие нуклеиновые кислоты, типа рибонуклеазы и т. п. ферменты, гидролизующие сахара, типа лизоцима и т. п.). В самом общем смысле субстрат для ферментов такого типа удобно рассматривать в виде плоскости (гидрофобная полимерная подложка) с активными точками , обладающими чрезвычайно высокой избирательностью. Каталитической активностью такой поверхности можно было бы управлять, например регулируя молекулярные вращения или дегидратируя субстрат, который является стабильным в гидратированном состоянии. Стабилизация переходных состояний в этом случае осуществлялась бы в результате как электростатических сил, так и водородных связей. Практическое воплощение таких планов является, разумеется, очень трудной задачей. Например, при использовании лизоцима возникают сложности, связанные с тем, что глюкозное кольцо в процессе связывания субстрата переходит из устойчивой конфигурации типа кресло в неустойчивую конфигурацию типа ванна . [c.103]

Оба этих пограничных механизма пригодны для объяснения катализа лизоцимом. Группа карбоновой кислоты в активном центре фермента, по-видимому, передает протон уходящему атому кислорода. Это можно рассматривать либо как общекислотный катализ, либо как стабилизацию протонированной уходящей группы карбоксилатным ионом. Карбоксилатная группа в активном центре может ускорять реакцию или обеспечивая электростатическую стабилизацию образующегося иона карбония, или помогая замещать уходящую группу [92]. Первое предположение кажется более предпочтительным, поскольку организация атомов на активной поверхности фердшнта препятствует обычному 8 к2-замещению с линейным переходным состоянием, в то время как перевод субстрата в конформацию полукресла обеспечивает дополнительную стабилизацию образующегося иона карбония. Тем не менее трудно провести четкое разграничение между ионом карбония, стабилизированным соседней карбоксилатной группой [Ха, схема (88)], и напряженной связью между атомом углерода 1 и карбоксильной группой (Хб) [c.184]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология