Субстраты связывание с ингибиторами

Для решения различных вопросов, встающих при исследовании структуры и функции ферментов, часто используется подход, связанный с введением в активный центр фермента аналогов кофермента, субстрата или ингибиторов реакции. В то же время в ряде случаев необходимо, чтобы активный центр мог свободно взаимодействовать с участниками реакции и ее ингибиторами. Информация о связывании лигандов в активном центре в этом случае может быть получена из других областей молекулы белка, чувствительных к состоянию активного центра. [c.340]

Ферментативная кинетика, занимающаяся количественным изучением реакций, катализируемых ферментами, представляет собой область науки, в которой математические методы нашли самое широкое применение она имеет огромную практическую ценность для биохимика. Это самый важный метод установления механизма катализа, которым мы располагаем. Кинетические исследования позволяют определить сродство субстратов и ингибиторов к ферментам и специфичность их связывания, найти максимальную скорость процесса, катализируемого специфическим ферментом, а также решить многие другие задачи. [c.5]

Ингибиторы, структурно аналогичные субстрату, способны связы- аться с субстрат-связывающим центром. В случае истинного конкурент-.ного ингибирования должна иметь место конкуренция между субстратом и ингибитором за связывание с одним и тем же центром, а кроме того, связывание одного из этих лигандов должно исключать связывание другого. Сродство ингибитора к ферменту количественно выражается константой ингибирования Ki, которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермента с ингибитором Е1 [c.27]

Кооперативный характер связывания ферментов с субстратами имеет, пожалуй, такое же большое физиологическое значение, как и кооперативное связывание гемоглобина с кислородом, которое обеспечивает более эффективное высвобождение связанного кислорода в тканях (гл. 4, разд. Д, 5). Кооперативность связывания субстрата отсутствует в том случае, когда благодаря избытку активатора фермент переходит в состояние R (В), при котором связывающие центры ведут себя независимо. В то же время связывание активатора должно характеризоваться сильно выраженной кооперативностью, т. е. скорость реакции должна изменяться при изменении концентрации активатора сильнее, чем в случае гиперболической активации. Аналогичным образом кооперативное связывание ингибитора обеспечивает более быстрое выключение фермента при увеличении концентрации ингибитора. По-видимому, эволюция олигомерных ферментов (по крайней мере отчасти) обусловлена большей эффективностью механизмов регуляции, в основе которых лежит кооперативное связывание эффекторов. [c.39]

Пример неконкурентного ингибирования дезаминирование аминокислот, например, аланина и фенилаланина. Вероятно, связывание этих АК будет происходить неконкурентно, в разных участках фермента, так как структура АК различна. В этом случае при взаимодействии субстрата и ингибитора с ферментом нет конкуренции за связывание, но образуется непродуктивный тройной комплекс фермент-субстрат-ингибитор, поэтому максимальная скорость реакции будет меньше, чем при нормальных условиях. Оба вида ингибирования представлены графически на рис. 10. [c.34]

Электростатические взаимодействия вносят вклад в специфичность трипсина к остаткам Lys и Arg. Трипсин [244, 245, 536] связывает свои субстраты существенно тем же способом, что и химотрипсин. Однако трипсин специфичен к положительно заряженным остаткам субстрата боковая цепь Lys или Arg электростатически связывается с остатком аспарагиновой кислоты на дне связывающего кармана фермента. Кристаллографические исследования комплексов трипсина и белковых ингибиторов трипсина [269, 632] показали, что способ связывания очень сходен с образованием комплекса сериновая протеаза — субстрат. Очевидно, ингибитор точно-воспроизводит субстрат. Механизм, ведущий к расщеплению субстрата трипсином и к стабилизации комплекса трипсин — ингибитор-[269, 536], рассматривается в разд. 11.2. [c.248]

Изменяя структуру субстрата или ингибитора, можно определить, какие черты молекулы важны для связывания, и, следовательно, какие группы субстрата специфически связываются ферментом. Становится возможным, используя достаточное количество данных, представить себе геометрию центра связывания, предполагая его комплементарным структурам молекул субстрата или ингибитора, связывающихся наилучшим образом иными словами, вывести геометрию замка из формы ключа. Весьма детальные исследования такого рода в случае химотрипсина привели к формулированию требований ко всем четырем положениям, окружающим тетраэдрический а-углеродный атом аминокислотного остатка, атакуемого серином активного центра [97,98] заместители обозначены в соответствии с (58) . [c.511]

Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с Е8-комплексом. [c.151]

Подобно Три-108, остатки Трн-62 и Три-63 также расположены в щели для связывания субстрата, где расположен активный центр. Считается, что эти два остатка участвуют в связывании субстратов. После обработки лизоцима N-бромсукцинимидом пик III исчезает [26], что подтверждает его отнесение к Три-26, который, как известно, избирательно окисляется в этих условиях до оксин-дола [36]. При связывании ингибитора изменяются только положения пиков III и V. Это, ио-видимому, обусловлено образованием водородных связей NH-протонов с ингибитором, так что можно отнести пик V к Три-63. [c.359]

Очевидно, что такая информация может представлять большую ценность при детальном изучении связывания субстратов и ингибиторов с активным центром фермента. К сожалению, этот подход неприменим для другого наиболее изученного фермента — рибонуклеазы (см. разд. 14.2.3), поскольку этот белок не содержит триптофана. [c.359]

Связывание ионов, субстратов и ингибиторов с лизоцимом обсуждается в разд. 14.3.1. [c.362]

Знание величин ДЯ и Д5 может помочь также при идентификации природы кислотных или основных групп, от которых зависит ферментативная активность (см. гл. VII), и при решении вопроса о природе сил, обеспечивающих связывание субстратов или ингибиторов с ферментами. [c.35]

В результате изучения взаимодействия ферментов с субстратами и ингибиторами удалось выяснить ряд важных вопросов, касающихся механизма ферментативных реакций. Детальное рассмотрение всех этих исследований увело бы нас слишком в сторону. Поэтому мы остановимся только на некоторых выводах, имеющих непосредственное отношение к предмету этой книги. Прежде всего рассмотрим свойства самого фермента. Активность фермента, как правило, зависит от целостности его третичной структуры. Под действием денатурирующих агентов, изменяющих конформацию фермента, его активность либо уменьшается, либо исчезает полностью. По меньшей мере в одном случае — для рибонуклеазы — установлено, что связывание фермента с субстратом способствует сохранению его конформации даже в присутствии агентов, которые в отсутствие субстрата вызывают денатурацию. Вместе с тем не вся первичная структура необходима для обеспечения активности. Например, фермент папаин, по своим свойствам подобный протеолитическим ферментам, сохраняет свою активность при отщеплении 3/5 его молекулы. Активный фрагмент папаина сохраняет чувствительность к действию денатурирующих агентов, и это свидетельствует о том, что для обеспечения активности необходима определенная третичная структура. В свете этих данных вЪз-никает вопрос почему молекулы ферментов так велики [c.395]

Типичным примером проявления электростатических сил в фермент-субстратных взаимодействиях может служить связывание положительно заряженной группы ацетилхолина и подобных ему субстратов и ингибиторов с анионным центром фермента ацетилхолинэстеразы (I) [2]. [c.274]

Конкурентные ингибиторы имеют структуру, подобную субстрату, и конкурируют с ним за место связывания в активном центре фермента. Как видно из рис. 41, в случае конкурентного торможения ингибитор И) присоединяется к ферменту в том же участке, что и субстрат, в результате чего субстрат уже не может соединиться с ферментом. Конкурентное ингибирование обратимо и зависит от концентрации ингибитора и субстрата. При высокой концентрации субстрата такие ингибиторы неэффективны. [c.102]

Мы уже видели, что связывание субстратов и ингибиторов с лизоцимом и рибонуклеазой изменяет резонансные сигналы пептидных групп ароматических аминокислот, расположенных вблизи места связывания (см. разд. 14.2.2 и 14.2.3). Особенно важна информация, полученная при изучении резонансных сигналов от гистидиновых и триптофановых остатков лизоцима. Мы теперь рассмотрим прямые наблюдения резонансных сигналов малых молекул. Можно обнаружить изменения химических сдвигов и ширины линий для многих систем. Для определения положения активного центра эти наблюдения, по меньшей мере, столь же полезны, как и изучение резонансных сигналов протонов аминокислотных остатков белка. Однако, поскольку основное внимание в этой книге сосредоточено главным образом на самих полимерах, наше обсуждение этого аспекта исследований белков с помощью ЯМР будет относительно кратким. [c.387]

Прежде всего необходимо отметить, что круг ингибиторов обычно значительно превышает круг субстратов и специфичность фермента к ингибированию оказывается меньше его субстратной специфичности. В общем виде причина этого достаточно ясна даже при рассмотрении одних лишь конкурентных ингибиторов. Если для катализа необходима адсорбция субстрата и его строгая ориентация относительно каталитических групп, то для ингибирования достаточно не только взаимодействия со всем адсорбционным центром, но и простого связывания ингибитора отдельными элементами адсорбционного центра, как правило состоящего из нескольких участков адсорбции. Поэтому изучение ингибирующего действия разнообразных структурных аналогов субстратов помогает в исследовании адсорбционных центров ферментов и свойств их отдельных элементов, а также химической природы основных, активных для катализа групп фермента. [c.70]

Рассмотренные выще механизмы способны описывать многие сложные эффекты, и кинетическое уравнение может иметь очень сложную форму. Но в общем случае концентрация [ЕЗ] не может возрастать быстрее, чем растет [3]. Однако при некоторых экспериментальных условиях субстраты или ингибиторы оказывают большее влияние на концентрацию комплекса. Другими словами, получаются 3-образные кривые типа кривой связывания кислорода гемоглобином (разд. 7.13). В особенности это относится к ферментам, играющим важную роль в регулировании обмена веществ. Подобные кооперативные эффекты встречаются в случае ферментов с несколькими активными центрами, поскольку кооперативный эффект подразумевает возрастание сродства второго активного центра к субстрату, когда первый центр занят. Как и в случае гемоглобина, взаимодействия такого типа сопровождаются структурными изменениями. Согласно модели Моно — Шанжо — Ваймана, фермент с несколькими активными центрами может находиться по крайней мере в двух состояниях. Это, вероятно, слишком упрощенная картина, но два является минимальным числом состояний, необходимым для объяснения наблюдаемых эффектов. Предполагается, что в обоих состояниях конформации всех субъединиц одинаковы. Воздействующая на систему молекула (эффектор), которая может быть молекулой субстрата, смещает равновесие в сторону одного или другого из этих двух состояний. Если эффектор смещает равновесие в направлении увеличения скорости реакции, то такой эффектор называется активатором. Если же его действие приводит к снижению скорости реакции, то он называется ингибитором. Как и в случае гемоглобина, воздействие усиливается тем, что одна молекула эффектора оказывает влияние на несколько каталити-21 [c.323]

Чтобы выявить наличие кон курентного ингибирования, обыч-но строят графики зависимости u/[S] от V, описываемые уравнением (6-45), или 1/и от 1/[S] [уравнение (6-46)] для реакций, протекающих в отсутствие ингибитора и в его присутствии при одной или нескольких фиксированных концентрациях. 1ри наличии конкурентного ингибирования получают семейство прямых, пересекающихся с одной и осей в точке 1/Утах (рис. 6-6). Иначе говоря, максимальна скорость не изменяется в присутствии конкурентного ингибитора. Если взять достаточно высокую концентрацию субстрата то всегда можно насытить фермент субстратом и ПОЛНОСТЬЮ -исключить связывание ингибитора. Из изменения наклона с ростом концентрации ингибитора нетрудно при помощи уравнений (6-45) или (6-46) рассчитать величину Kl. [c.28]

Какова структура активных центров Благодаря кристаллографическим исследованиям мы можем неиосредственно увидеть , как устроено все большее и большее их число. Однако рентгеноструктурный анализ обычно не позволяет получить четкого представления о конформацион-ных изменениях, обеспечиваюш их индуцированное соответствие. Кроме того, кристаллографические исследования с высоким разрешением проведены лишь для относительно небольшого числа ферментов. Поэтому для выяснения структуры активного центра энзимологи продолжают широко использовать традиционные химические методы картирования , измеряя константы связывания ингибиторов, структуру которых последовательно изменяют, и исследуя, как влияют изменения структуры субстратов на связывание и скорость реакции. Хорошим примером исследования такого рода может служить работа Мейстера (Meister) и его сотрудников, исследовавших глутаминсинтетазу из мозга овцы. Субстратами фермента являются как D- и L-глутаминовая кислоты, так и а-аминоадипиновая кислота. В то же время из десяти монометильных производных D- и L-глутаминовой кислот субстратами глутаминсинте-тазы могут служить только три. Если допустить, что субстраты связываются в полностью вытянутой конформации, то все атомы водорода, замена которых не приводит к исчезновению активности, лежат с одной стороны остова молекулы (за плоскостью рисунка на следующих двух схемах) [c.43]

Н СОННН в данном случае ингибитор, а не субстрат . Очевидно, что в фермент-ингибиторных комплексах этого типа интермедиат не может трансформироваться ни в прямом, ни в обратном направлениях, по-видимому, вследствие слишком прочнога связывания ингибитора. Прямая реакция, распад тетраэдрического интермедиата, включает расщепление связи С—М, что может иметь место в случае протонирования атома азота, т. е. превращения последнего в удовлетворительную уходящую группу. Вероятным источником необходимого для этого протона является имидазольная группа системы переноса заряда. Подобный процесс может иметь место в том случае, если конформация тетраэдрического интермедиата изменяется по сравнению с показанной на схеме (31) (что дает важный дополнительный выигрыш, заключающийся в предотвращении обратной реакции) так, как это показано на схеме (32). [c.492]

Определяющим структурным требованием к хорошему субстрату или ингибитору химотрипсина является наличие аромати-чеекой группы R в (58) . Центр связывания этой группы можно легко распознать в трехмерных структурах комплексов фермента. [c.512]

В отношении субстрата, так и ингибитора, имеющих обычно совершенно различные трехмерные структуры и, таким образом, шллостеричных- [152]. Последнее непременно предполагает невозможность для ингибитора связываться в активном центре, подобно классическим (изостерическим) ингибиторам. Большое число данных, включая рентгеноструктурные, подтверждают предположение, что в регуляторных ферментах имеются отличающиеся друг от друга каталитические (субстрат-связывающие) и ал-лостерические (ингибитор-связывающие) центры. Эффект связывания ингибитора в аллостерическом центре передается через белок — посредством ряда конформационных изменений (часто путем легко регистрируемого взаимодействия между субъединицами) и в конечном счете влияет на активный центр. Таким путем не участвующие в реакции, катализируемой определенным ферментом, метаболиты могут регулировать его активность, модифицируя либо связывание субстрата, либо каталитическую функцию, либо, наконец, оба этих процесса [147, 148]. [c.538]

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) [c.148]

Таким образом, чем сильнее взаимодействие субстрата и ингибитора с ферментом, тем выше комплементарность связываю-ших участков. Это справедливо не только в отношении пространственного расположения, но также и в отношении природы комп-лементирующих частей молекул. Однако способы привязки аффинного лиганда к нерастворимому носителю в значительной степени ограничены, потому что лиганд должен быть привязан той частью молекулы, которая не принимает участия в связывании. Кроме того, иммобилизация аффинанта не должна приводить к изменению его конформации или отрицательно влиять на природу его связывающих участков. Эффективность аффинного сорбента зависит от степени, до которой эти требования выполняются. [c.73]

Данные о специфичности ферментов по отношению к субстратам также свидетельствуют о важности конформации. Протео-литические ферменты катализируют перенос групп (например, воды при гидролизе) только к Ь-изомерам субстратов. О-изо-меры субстратов обладают способностью образовывать комплексы с этими ферментами, причем в ряде случаев эти комплексы даже стабильнее, чем комплексы с субстратами. Таким образом, О-субстраты являются ингибиторами. По-видимому, субстрат соединяется с активной поверхностью фермента по крайней мере в трех точках, так как если бы число критических точек равнялось двум, то между Ь- и О-субстратами в отношении связывания их с ферментом не было бы никакой разницы. Обладая собственной оптической активностью, ферменты могут катализировать синтез оптически активных продуктов из оптически неактивных субстратов. Функции фермента заключаются в том, что он связывает субстрат таким образом, что снижается свободная энергия активации данной реакции и она протекает с такой скоростью, которая приемлема для биологических условий. Возможно, что наиболее высокая степень комплементар- [c.396]

С изолейцином норлейцина, который вытесняет изолейцин из этого центра, активность восстанавливается. При низких концентрациях субстрата валин активирует треониндезаминазу, увеличивая ее сродство к треонину. Между валином и изолейцином существуют отчасти конкурентные отношения. Таким образом, можно заключить, что валин взаимодействует с каким-то третьим центром фермента, увеличивая сродство активного центра к субстрату (треонину) и уменьшая сродство центра для связывания ингибитора к изолейцину. [c.17]

Этот случай обычно отличают от ингибирования и называют его инактивацией . На практике, однако, этому различию не всегда придают значение, и это весьма прискорбно, так как внешне кинетическое поведение в этом случае ничем не отличается от случая чистого неконкурентного ингибирования, которое имеет совершенно иные причины Ч Особенно важно, что в случае. необратимого ингибирования ничего нельзя сказать относительно места связывания ингибитора в молекуле фермента это место может совпадать и может не совпадать с местом связывания субстрата. Все эти сообра- [c.71]

Существуют экспериментальные работы прямо показывающие, что в некоторых случаях конформационные изменения в белке, возникающие при связывании органических лигандов (субстратов, кофакторов, ингибиторов), зависят от структуры лиганда. В качестве примера рассмотрим динамику связывания с апофермен-том флаводоксина из азотобактера — кофактора флавннмононук-леотида (ФМН). [c.224]

А. Как видно из графика, АТФ может служить и субстратом, и ингибитором реакции. АТФ присоединяется к двум участкам — каталитическому и аллостерическому. Фруктозо-6-фосфат противодействует связыванию АТФ аллостерическим участком и таким образом снимает торможение, но не влияет на связывание ЛТФ каталитическим участком. —повышающееся содержание фруктозо-6-фосфата. Б. Нз графика можно пидеть, что АТФ сильно уменьшает сродство фермента к фруктозо-Ь-фосфату. Иаппотив, положительные модуляторы (АМФ, АДФ, фруктозофосфат и Ф ) снимают этот эффект АТ4 и повышают сродство фермента к фруктозо-6-фосфату. I — АМФ, АДФ, фруктозодифосфат и Ф // — АТФ /У/— контроль. В. На графике показана активация фосфофруктокиназы (У) продуктом реакции. пр1 водящая к экспоненциальному увеличению актлвностн во времени на большинство других ферментов (//) продукты реакции действуют как ингибиторы. [c.50]

Электростатическая модель мицеллярного эффекта при гидролизе моноэфиров фосфорной кислоты подтверждается также результатами опытов по ингибированию мицеллярного катализа [136, 139]. Показано, что катализ гидролиза дианионов динитрофе-нилфосфатов БЦТА подавляется низкими концентрациями многих солей (рис. 9). Простые электролиты, такие, как хлористый натрий, фосфат натрия, динатрийборат, мало влияют на каталитические свойства мицелл. Однако соли с объемистыми органическими анионами, такие, как п-толуолсульфонат натрия и натриевые соли арилкарбоновых и арилфосфорных кислот, сильно подавляют мицеллярный катализ БЦТА. По уравнению (14) и рис. 10 были рассчитаны константы ингибирования Ki [139], представленные в табл. 9. Линейность графиков на рис. 10 подтверждает предположение о конкурентном ингибировании, т. е. о вытеснении молекулы субстрата из мицелл при связывании ингибитора (разд. П1). [c.286]

Ингибирование ферментативных реакций может происходить в результате связывания ингибирующих веществ с различными формами фермента, субстратами или активаторами. Мы огра-ничихмся обсуждением связывания ингибиторов с различными формами фермента, так как это основной тип связывания в процессе ингибирования продуктом. Если в систему, где протекает обычная химическая реакция в прямом направлении с доступной измерению скоростью, добавить один из продуктов реакции, то общая скорость прямой реакции уменьшится, потому что увеличится скорость обратной реакции. Точно так же замедляется прямая реакция при добавлении продукта в реакцию, катализируемую ферментом. Однако последний случай более сложен, так как мы должны при этом учитывать образование специфического комплекса фермент — продукт. В действительности именно это усложнение позволяет нам применять в модельных исследованиях ингибирование продуктом. Прежде чем мы увидим, как работает метод Клеланда, необходимо объяснить некоторые основные правила, касающиеся анализа с помощью ингибирования продуктом. [c.358]

Надежные данные о типах прямых связей, образуемых атомом металла активного центра с субстратами и ингибиторами, можно получить с помощью рентгеноструктурного анализа, а также методом ЯМР. Ущирение резонансных линий протонов нескольких ингибиторов общего вида R OO- при добавлении Мп-КПА можно объяснить тем, что группа С00 находится во внутренней координационной сфере иона Мп [66, 71]. Влияние фенилпропионата на резонанс ядер присоединяемых к Мп в Мп-КПА, подтверждает этот вывод [67, 72]. Однако полное описание влияния металла на геометрию связывания субстрата или ингибитора требует точного сравнения геометрии апо-КПА и различных металло-КПА в присутствии и в отсутствие субстратов. [c.542]

Межмолекулярные взаимодействия зарял енных и полярных и некоторых нейтральных молекул в растворах, как правило, обеспечиваются электростатическими силами, водородной связью или переносом заряда. Однако-в водном растворе эти типы взаимодействий малоэффективны (гл. 6, 7 и 9) ввиду высокой сольватирующей способности молекул воды, прочности образуемых ими водородных связей и слабости обычных взаимодействий с переносом заряда в основном состоянии. Чтобы объяснить большие энергии связывания, обнаруживаемые для фермент-субстратного взаимодействия, и связывания малых молекул с белками часто необходимо учитывать еще один тип взаимодействия, который за неимением точного термина условно назовем гидрофобной связью . Гидрофобные силы , вероятно, являются наиболее важным фактором, обеспечивающим нековалентное межмолекулярное взаимодействие в водном растворе. Свободные энергии связывания субстратов и ингибиторов с активными центрами ферментов часто равны примерно —10 ккал/моль (—42-10 Дж/моль) и менее, причем лишь небольшую долю-этой величины можно отнести за счет других типов взаимодействия. Сила и специфичность связывания малых молекул белками видны особенно четко при взаимодействии гаптенов с антителами, движущей силой которого обычно является гидрофобное взаимодействие. Свободная энергия связывания е-дини-трофениллизина специфическим для него антителом, которая почти полностью обусловлена взаимодействием с динитрофенильной группой, приблизительно равна —12 ккал/моль (—50-10 Дж/моль), а энергии связывания малых слабополярных гаптенов обычно лежат в интервале от —5 до —10 ккал/моль (от —21 до —42-10 Диг/моль) [1, 2]. [c.303]

ТОГО фермента, который этим ингибитором регулируется. Один из этих способов заключается в том, что ингибитор нарушает образование фермент-субстратного комплекса, т. е. понижает сродство активного центра фермента к его субстрату. Другой способ состоит в том, что ингибитор нарушает превращение связанного с ферментом субстрата в продукт, т. е. снижает число оборотов. Как бы то ни было, но в обоих случаях ингибитор образует комплекс с ферментом, связываясь со специфическим участком на его поверхности. Этот специ( )ический участок имеет высокое сродство к ингибитору и полностью отличен от активного центра. (Неиден-тичность активного центра и участка связывания ингибитора почти вытекает уже из того, что структура субстратов, к которым приспособлен активный центр антранилат-синтетазы, —хоризмовой кислоты и глутамина — совершенно не похожа на структуру ингибитора этого фермента — триптофана.) Соединение ингибитора с участком его связывания вызывает изменение третичной и(или) четвертичной структуры фермента. [c.110]