Разделение и очистка ферментов

Иониты применяют в биологии для разделения органических кислот, аминокислот и углеводов, для выделения витаминов, алкалоидов и антибиотиков, для очистки ферментов и других веществ. Ионный обмен приобретает все большее значение в агропочвоведении и в агрохимическом анализе. А на промышленных предприятиях и электрических станциях иониты используют для умягчения или деминерализации воды. [c.302]

В биологии ионный обмен используют для разделения органических кислот, аминокислот и углеводов или выделения витаминов и антибиотиков, для очистки ферментов и других веществ. [c.142]

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Большое значение для очистки и разделения отдельных ферментов друг от друга приобрели методы, основанные на возможности избирательной адсорбции ферментов на поверхности частиц мелко раздробленных твердых тел (тончайших порошков). Этот способ очистки ферментов впервые был предложен А. Я- Данилевским. Позднее метод адсорбции был усовершенствован и с успехом применялся Вильштеттером и др. [c.126]

После того как было установлено, что в реакции ферментативного переаминирования вступают очень многие аминокислоты, стало очевидным, что в природе существует множество различных трансаминаз. Однако исследования по разделению и очистке этих ферментов не поспевают за открытием новых реакций переаминирования. Это объясняется, очевидно, тем, что разработка способов очистки ферментов вообще представляет сложную задачу, а может быть, и тем, что внимание исследователей распыляется в связи с большим разнообразием субстратов переаминирования, существование которых установлено или предполагается. [c.229]

Иониты применяют в биологии для разделения органических кислот, аминокислот и углеводов, для выделения витаминов, алкалоидов и антибиотиков, для очистки ферментов [c.279]

Фракционирование и очистка ферментов с помощью органических растворителей — один из основных методов очистки белковых веществ. Чаще всего используются этанол, изопропанол, ацетон, метанол, диоксан и реже — эфир, диэтилкарбинол, коллидин, некоторые ароматические и гетероциклические амины. Большинство ферментов при комнатной температуре легко денатурируется органическими растворителями, в особенности в присутствии заметных количеств ионов солей. Поэтому на всех этапах работу следует проводить в условиях значительного охлаждения при температурах, близких к точкам замерзания обрабатываемых смесей. Прибавлять растворитель начинают при 0°С, а разделение (фракционирование) смеси ведут при —5°, —6°, до —10°С и даже до —20°С. Раствор не должен нагреваться от выделения тепла при смешивании растворителя с водой. Полученные фракции не должны нагреваться даже на несколько градусов, пока растворитель не будет удален, или пока его концентрация не станет безопасной при разбавлении. [c.145]

За последнее время фракционную адсорбцию все чаще проводят в колонках. Колоночная техника используется в трех важнейших способах разделения белков, основанных а) на явлениях адсорбции, б) на ионном обмене и в) на эффекте молекулярного сита (гель-фильтрации). Во всех этих случаях (во множестве известных вариантов) техника выделения и высокой очистки ферментов, а также иных белков остается в принципе одинаковой. Она быстро развивается и можно полагать, что будущее перечисленных приемов очень велико. [c.150]

На конечных стадиях очистки ферментов часто используется электрофорез. Это — физический метод, в основе которого лежит различная скорость движения отдельных белков в электрическом поле, определяемая величиной свободного заряда их молекул. Так как количественные соотношения положительно и отрицательно заряженных групп в белках неодинаковы, то различия в их свободном (суммарном) заряде могут служить основой для электрофоретического разделения белковых смесей. Когда белок находится в изоэлектрическом состоянии, т. е. его суммарный отрицательный заряд равен положительному, то в электрическом поле он неподвижен. При различных pH среды он может двигаться либо к аноду, либо к катоду, причем с неодинаковой скоростью. [c.154]

Препараты растительных и особенно микробных ферментов, выпускаемые промышленностью, обычно представляют собой смеси или комплексы катализаторов, различных (или близких) по своим свойствам. Так как исследования по разделению и очистке ферментов сложны и трудоемки, отдельные представители до сих пор мало выделялись и не были подробно изучены. Сведения об их поведении и свойствах очень ограничены. Работы в данном направлении — одна из главных задач во всех областях практического применения ферментативного катализа. [c.326]

В то же время начинается выдающаяся научная деятельность замечательного русского естествоиспытателя А. Я. Данилевского, которого по заслугам можно считать основоположником крупных биохимических исследований в России. Труды А. Я. Данилевского охватывают весьма раз-. личные области биохимии, но здесь естественно упор будет сделан на работы по белкам, исследованию которых ученый посвятил несколько десятилетий. Уже в своей докторской диссертации 24-летний (1863) А. Я. Данилевский [256] с успехом применил адсорбционный метод разделения и очистки ферментов поджелудочной железы. Подробная разработка этого современного способа изучения ферментов связана с исследованиями Виль-штеттера [257]. [c.262]

Электрофорез используется для выделения и разделения ферментов на конечных стадиях очистки, а также для препаративных и аналитических целей. Для препаративного выделения и очистки ферментов проводят зонный электрофорез па бумаге и в блоках или на колонках с различными наполнителями (целлюлозным порошком, крахмалом и другими), а также электрофорез в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. Электрофорез в гелях отличается от электрофореза на порошкообразных или пористых носителях. Здесь сочетаются два метода разделения ферментов — электрофоретический и метод, основанный на гель-фильтрации. Фракционирование ферментов на основе различной электрофоретической подвижности оказывается одним из самых эффективных методов. [c.201]

В 1863 г. А. Я. Данилевский впервые разработал метод адсорбционного разделения и очистки ферментов поджелудочной железы. Этот метод нашел позже широкое применение в исследованиях Вильштеттера и его учеников по выделению ферментов и изучению их химии. [c.12]

Методы, описанные в гл. 3 и 4, связаны с фазовыми изменениями. Белки переходят из жидкой фазы (т. е. из раствора в твердую (в осадок или на поверхность адсорбента) и обратно. Не все белки выдерживают жесткие условия, характерные для этих методов, существуют более мягкие способы разделения белков, которые при этом находятся в растворе в течение всей процедуры. Один из них — гель-фильтрация — относится к важнейшим методам, применяемым для очистки ферментов и других белков, и будет рассмотрен детально. [c.197]

Другие методы, сгруппированные под общим названием электрофоретические методы , распространены не столь широко по причинам, которые будут рассмотрены в разд. 5.2 и 5.3. Третий, мало используемый прием разделения веществ в растворе— фазовое распределение, — при котором белки могут перемещаться из одной жидкой фазы в другую, описан в разд. 5.4. В качестве общего метода разделение веществ в растворе играет важную роль как в научных исследованиях, так и в промышленной очистке ферментов и других белков. [c.197]

Всегда принималось как нечто само собой разумеющееся, что очистка ферментов должна выполняться на холоде из-за того, что ферменты весьма лабильны снижение температуры на 20 °С понижает скорость большинства процессов в 3—5 раз, и потому проведение операций с ферментами на холоде более целесообразно. Однако низкая температура замедляет также и процессы, связанные с разделением, например при ионообменной хроматографии следовательно, если при этом приходится увеличивать время разделения в той же самой степени, то никакого выигрыша е достигается. Это не относится к денатурации, так как она очень сильно зависит от температуры (см. разд. 3.5). Но большинство белков, особенно у теплокровных млекопитающих, проявляет незначительные признаки тепловой денатурации при температуре ниже 40°С, если значение pH близко к физиологической величине, они сохраняются в этих условиях в течение нескольких дней. Только у видов с постоянно холодными тканями, например у рыб, обитающих в холодной воде, тепловую денатурацию может вызвать и комнатная температура. Некоторые ферменты даже денатурируют (изменяют свои естественные свойства) под воздействием холода — явление, известное как холодовая денатурация, — в результате ослабления гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих структуру молекулы. Поэтому, хотя обычно и рекомендуется держать растворы на льду в то время, когда они не подвергаются фракционированию, иногда при проведении фракционирования их лучше подогреть. Часто нет необходимости работать в холодной комнате всегда удобнее этого не делать. [c.252]

В химической и нефтехимической промышленности эти методы могут использоваться для разделения углеводородов, смещения равновесия химических реакций путем удаления одного из ее продуктов, разделения азеотропных смесей, концентрирования растворов, очистки или отделения высокомолекулярных соединений из растворов, содержащих низкомолекулярные компоненты и т. п. в биологии и медицине — для выделения и очистки биологически активных веществ, вакцин, ферментов и т. п. в пищевой промышленности — для концентрирования фруктовых и овощных соков, молока и молочных продуктов, получения высококачественного сахара и т. п. [c.7]

Зонный способ применяют также при разделении солевых смесей, очистке парафина, бензола, нафталина, антрацена и многих других препаратов, для концентрирования разведенных растворов ферментов, вирусов, суспензий бактерий и т. д. [c.462]

Предназначены для разделения, концентрирования и очистки растворов методом обратного осмоса и ультрафильтрации. Применяются для деминерализации сточных вод и извлечения компонентов из промышленных стоков химических и других производств, а также для концентрирования ферментов, биологически активных веществ в микробиологической, химической, целлюлозно-бумажной и других отраслях промышленности. [c.919]

На кафедре проводятся исследования по синтезу и изучению свойств синтетических неионных водорастворимых полимеров. Такие полимеры и гидрогели на их основе находят широкое применение в качестве флоку-лянтов для очистки сточных вод, для концентрирования и извлечения металлов, в качестве структурообразователей почв, в качестве плазмозаме-нителей, для стабилизации и очистки ферментов. Методом радикальной полимеризации синтезированы термоосаждаемые водорастворимые полимеры на основе винилкапролактама. Показано, что меняя природу со-мономера можно получать сополимеры с различной температурой фазового разделения., с различным конформационном состоянием макромолекул. При этом большое значение приобретает химическая природа растворителя. Способность к комплексообазованию таких полимеров позволило разработать способ получения гранулярного носителя и иммобилизации в него широкого спектра соединений, от пигментов до живых клеточных [c.115]

Еще в 1966 г. Бернарди и соавторы [Bernardi et al., 1966] продемонстрировали возможность использования хроматографии на оксиапатите для очистки ферментов иа примере разделения различных нуклеаз селезенки (рис. 102). Элюцию вели линейным градиентом концентрации фосфатного буфера (0,05—0,5 М), pH 6,8. [c.233]

Применеиие. Ж х важнейший физ -хим метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов белков ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых к-т, углеводов, липидов, гормонов и т д, изучения процессов метаболизма в живых организмах лек препаратов, диагностики в медицине, анализа продуктов хим и нефтехим синтеза попупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод, изучения изотерм сорбции из р-ра, кинетики и селективности хим [c.153]

Гель-хроматография (гель-фильтрация, или ситовая хроматография) — метод разделения, очистки и анализа веществ, основанный на различии в размерах или массе молекул. В качестве стационарной фазы используют различные гели с трехмерной сетчатой структурой декстраны (полисахариды), полиакри ламиды, пористые силикагели, цеолиты и др. При разделении смеси небольшие молекулы диффундируют через поры набухшего в растворителе геля, а крупные молекулы проходят через пространство между частицами геля. При промывании геля растворителем в первую очередь перемещаются крупные молекулы, а затем уже мелкие, т. е. компоненты смеси элюируют в порядке уменьшения их молекулярной массы. Гель действует как молекулярное сито. Аппаратурная простота метода и мягкие условия разделения способствовали особенно широкому применению гель-хроматографии в биохимических исследованиях. Основное назначение гель-хроматографии — разделение высокомолекулярных веществ. С ее помощью выделены и очищены многие ферменты, пептидные гормоны, нуклеиновые кислоты. [c.498]

Чтобы вьщелить какой-то один специфический белок из смеси многих белков, нужно найти удобный способ определения концентрации этого белка, который бы контролировал каждую стадию разделения. Например, если мы ведем очистку фермента, то, измеряя его каталитическую активность, мы можем отличать его от всех других белков. [c.146]

Биоорганическая химия — раздел органической химии, сложившийся во второй половине XX в. Она изучает органические вещества, участвующие в процессах жизнедеятельности, метаболизма. биополимеры (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты и т. п.), биорегуляторы (ферменты, гормоны, витамины и др.), а также синтетические биологические активные соединения (лекарственные препараты, ростовые вещества, гербициды и т. п.). В задачи б1юорганической химии входит изучение строения и синтез природных и синтетических биологически активных соединений, выяснение зависимости между их строением и биологическим действием, изучение их химических превращений внутри и вне организмов. Решение всех этих задач стало возможным только после появления современных физических методов разделения, очистки и исследования органических соединений. [c.504]

Первое применение) адсорбции для разделения и очистки ферментов было осуществлено русским биохимиком А. Я. Данилевским в 1862 г. С помощью свежеосажденного коллодия, использованного в качестве адсорбента, он отделил в панкреатическом соке амилазу от трипсина. Однако эта работа не давала общего метода анализа, который можно было бы применять для тонкого разделения сложных смесей. Такой общий адсорбционный метод анализа бьш впервые разработан М. С. Цветом. В основу метода М. С. Цвет положил избирательность адсорбции, т. е. способность разных веществ удерживаться на поверхности адсорбента при одинаковых условиях с разной интенсивностью. Он писал Для того, чтобы два находящихся в растворе вещества могли быть разъединены адсорбционным методом, необходимо, чтобы они занимали неодинаковый ранг в адсорбционном ряду , иначе говоря, имели бы разные коэффициенты адсорбции. М. С. Цвет обнаружил, что при фильтрации раствора растительк-ых пигментов через колонку с адсорбентом пигменты располагаются по длине колонки в виде отдельных зон. Исходя из этого, он сделал вывод, что зональное распределение составных частей раствора выражает относительное положение последних в адсорбционном ряду . Даже разница в таких свойствах двух веществ, как, например, молекулярная масса. [c.5]

Тот факт, что подобные денатурированные молекулы ДНК являются более эффективной затравкой, чем нативные двойные спирали, показывает, что синтез Корнберга идет путем сорбции мононуклеозидтрифосфатов па одиночной цепи ДНК. В этой связи интересно было испытать в качестве матрицы ДНК из бактериофага ФХ174, которая состоит из одиночных нитей. Оказалось, что эта ДНК является, в согласии с ожиданиями, вдвое более эффективной затравкой, чем обычная ДНК со структурой двойной спирали. В последнее время обнаружено, что более тщательная очистка фермента Корнберга делает его неспособным к использованию двойных спиралей в качестве матриц. По-видимому, существует отдельный фермент, ведущий предварительно процесс разделения двойных спиралей па одиночные нити, после чего опи редуплицируются по принципу комплементарности. [c.242]

Первые успехи в очистке ферментов были достигнуты Э.Брюкке (20), разработавшим метод очистки ферментов с помошью адсорбции. Первое по-настоящему успешное разделение ферментов (трипсина и панкреатической амилазы) было осуществлено в 1862 г. А.Я.Данилевским (21) путем адсорбции на коллодии. [c.173]

При контроле очистки и разделения дегидрирующих ферментов, а также цри испытании их активности по отношению к различным субстратам были использованы несколько методов оценки, которые можно разделить на две группы [34, 106]. К первой из них относится непосредственное определение дегидрированных продуктов реакции методом хроматографии на бумаге по УФ-спектру или цветным реакциям с фенолами, образующимися при 1,2-дегидрировании 19-норстероидов. Вторая группа методов оценки активности основана на способности стероид-дегидрогеназ использовать в качестве акцепторов электронов синтетические красители, восстановление которых в процессе реакции может быть прослежено спектрофотометрически. Обе группы методов дают совпадающие результаты. [c.154]

При проведении гель-фильтрации в препаративном масштабе, например при очистке ферментов и антител, часто приходится идти на компромисс, выбирая между высокой степенью разрешения и большой скоростью потока. Таким образом, хорошее разделение в какой-то мере приносится в жертву при использовании более крупных частиц геля, позволяющих быстрее пропускать через колонку нужный объем жидкости. Пористость частиц должна быть подобрана (часто эмпирически) так, чтобы можно было разделить как можно больше компонентов и чтобы на кривой элюирования нужный компонент располагался между Уо и Уо+У1. Для этого успешно применяется либо только одна гель-фильтрация, либо гель-фильтрация в сочетании с другими способами разделения. Молекулярную массу растворимых белков можно определять с помощью гель-фильтрации на сефа-дексах 0-75 и 0-100 [30, 50]. Для этого строят график линейной зависимости отношения Ух1Уо, где Ух — объем пика неизвестного компонент-э, а Ко — свободный объем, от логарифма молекулярной массы ряда ферментов и белков с известными молекулярными массами. Молекулярную массу неизвестного компонента находят по графику. Этот очень полезный метод в основном вытеснен сейчас другим, более быстрым и удобным методом диск-электрофореза в геле (разд. 16.5.1). [c.225]

Ультрафильтрация. В отличие от других способов концентрирования ультрафильтрация позволяет одновременно удалить из растворов все низкомолекуляриые балластные примеси, т. е. она одновременно выполняет функции и концентрирования, и очистки. Поскольку процесс основан на разделении веществ по молекулярной массе, он является идеальным именно в применении к очистке ферментов не требует изменения температуры и фазового состояния, проводится без добавления химических реагентов, позволяет получить теоретически любую необходимую концентрацию белка и достичь любой заданной степени очистки от примесей. [c.129]

GGT из почек мыши. Чувствительный электрофоретический метод разделения смеси GGT-антител позволяет продемонстрировать сильное иммуновзаимодействие между GGT из почек мыши и антителами против GGT из почек крысы. Это подтверждает возможность использования иммобилизованных антител против GGT из почек крысы в качестве иммуноадсорбента для очистки GGT из почек мыши. Данные по очистке фермента из почек мыши суммированы в табл. 7. Подробная методика во многом аналогична описанной выше общей методике. После повторной хроматографии активность GGT увеличивается в 530 раз при суммарном выходе 35%. [c.160]

Электрофоретические стадии не так уж часто вк 1ючаются в схемы очистки ферментов. Для этого есть много причин, в том числе сложность и дороговизна соответствующей аппаратуры, а также трудности, связанные с ее эксплуатацией. Еще одна, не менее важная причина — зто то, что электрофоретическое разделение зависит преимущественно от разницы в величине зарядов (или изоэлектрических точек) разделяемых белков — принцип, который широко применяется в ионообменной хрома- [c.213]

Основными этапами выделения любой рестриктазы является получение бесклеточных экстрактов и собственно очистка целевых ферментов, осуществимая с применением традиционных приемов препаративной биохимии белковых соединений (высаливание, хроматографическое фракционирование и т. д.). Вместе с тем следует отметить, что процессам выделения рестриктаз, как и других ферментов нуклеинового обмена, характерен ряд специфических особенностей. В первую очередь это замечание относится к тому вниманию, которое уделяется разделению целевых ферментов и нуклеиновых кислот, в принципе способных влиять на перераспределение как рестриктаз, так и нуклеаз между фракциями, получаемыми в результате применения различных методов выделения целевых ферментов. Поэтому этот этап является одним из ключевых в схемах выделения рестриктаз, от результатов проведения которого во многом зависит успех дальнейшей их очистки. [c.143]

Химики-органики развили методологию синтеза для того, чтобы лучще понимать механизмы органических реакций и создавать новые соединения. Биохимики в свою очередь изучают процессы жизнедеятельности, применяя биохимические методы исследования (очистка и определение активности ферментов, метод радиоактивных индикаторов в системах in vivo). Первые владеют методами, позволяющими получать аналоги соединений, присущих биологическим объектам, но часто затрудняются определить, какой синтез был бы полезен. Вторые способны оценить, что именно было бы полезно синтезировать в лаборатории, но не обладают нужной квалификацией для рещения этой задачи. Очевидна необходимость согласованного подхода, и химики-биоорганики часто работают в двух лабораториях в одной — синтезируя, в другой — изучая биологические объекты. В результате переплетения химических и биологических подходов была выработана качественно новая концепция построения моделей для изучения и разделения различных параметров сложного биологического процесса. Многие биологические реакции, а также действие (специфичность и эффективность) участвующих в них [c.13]

В курсе приведены многочисленные примеры практического применения главным образом газовой и молекулярной жидкостной хроматографии на адсорбци-онно или химически модифицированных адсорбентах для анализа углеводородов, их производных и гетероциклических соединений. Особое внимание уделено анализу вредных примесей, разделению углеводов, стероидов, гликозидов, азолов, азинов, а также таких важных галогенпроизводных, как фреоны и пестициды. Адсорбция микотоксинов, представляющих собой одну из серьезнейших пищевых и кормовых проблем, рассматривается как в аспекте хроматографического их анализа, так и в аспекте хроматоскопического исслв1Дования структуры их молекул. В конце курса приведены примеры адсорбции и хроматографии синтетических и природных макромолекул. Здесь рассматривается иммобилизация некоторых ферментов и клеток (например, для осахарнвания крахмала, изомеризации глюкозы, для решения проблем искусственной почки), а также вопросы хроматографической очистки вирусов, в частности, вирусов гриппа и ящура. [c.4]