Абсолютные концентрации ферментов

Международного биохимического союза рекомендован единый условный способ выражения абсолютных количеств фермента. За единицу количества фермента (Е) принимается такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 мин в стандартных условиях действия фермента (температура 25°, оптимальная концентрация субстрата и оптимальное значение pH). Производными единицами являются кило-Е (1000 Е) и милли-Е (0,001 Е). Содержание фермента в биологическом материале и в выделяемых ферментных препаратах может быть выражено числом единиц фермента на 1 мг веса или 1 мг белкового азота. Эта величина носит название удельной активности фермента. Сам по себе этот термин нельзя признать вполне удачным, поскольку здесь идет речь о содержании фермента в материале. Термин активность правильнее относить к свойствам фермента (см. ниже раздел Активность ферментов ). [c.10]

Рис. 72. Определение абсолютной концентрации фермента из кинетических данных при условии [Е]о= [5]о

Наиболее общим методом определения абсолютной концентрации фермента является измерение скорости гидролиза субстратов в условиях [Е] [8] [1659, с. [c.147]

Г. Абсолютные концентрации ферментов [c.152]

Определение абсолютной концентрации активных центров фермента из кинетических данных. В предыдущих разделах была рассмотрена кинетика ферментативных реакций в условиях избытка субстрата по сравнению с ферментом ([S]q [Elg). Рассмотрим теперь случай, когда концентрация субстрата сравнима по величине с концентрацией. фермента ([Slg [Е] ), и выведем уравнение для скорости ферментативной реакции, протекающей по двухстадийному мез анизму при условии быстрого установления равновесия на стадии образования фермент-субстратного комплекса [c.232]

Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сходства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет взаимодействовать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом полностью исключается перенос атома водорода от малоната. Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс. Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 4.20). [c.149]

Внешнее сходство уравнения Моно и уравнения Михаэлиса— Ментен рассматривается как неслучайное, основанием для чего служит общее положение о том, что в основе процессов роста и размножения микробных клеток лежат ферментативные реакции внутриклеточного синтеза. Необходимость сопоставления абсолютных скоростей ферментативной реакции с величиной относительной скорости процесса роста популяции микроорганизмов объяснялась тем, что в случае ферментативной реакции концентрация фермента остается постоянной, а при росте популяции количество фермента увеличивается с возрастанием числа особей. [c.78]

Активность фенолазы возрастает, как известно, медленнее, чем концентрация фермента. С другой стороны, активность фермента при окислении исследуемых фенолов оказалась наибольщей для гваякола, меньшей для пирогаллола и наименьшей для гидрохинона. Из этого вытекает, что смертельные дозы кислоты пропорциональны не абсолютным количествам фермента, а активности фенолазы при данных условиях опыта (концентрация фермента и природа субстрата). [c.452]

В тех случаях, ког Да определить абсолютную концентрацию активных центров по каким-либо причинам не удается, ограничиваются измерением активности фермента, выражая ее как количество фермента, необходимое для превращения 1 мкмоля субстрата в 1 мин. Предложено большое число субстратов и способов, в ток. числе автоматических [1688], позволяющих, определить очень низкие концентрации амидгидролаз [1689-1714]. Некоторые из используемых для этой цели субстратов перечислены в табл.33. [c.148]

Сорбция белка на стенках реакционного сосуда. В общем случае поверхность реакционного сосуда не является абсолютно инертной по отношению к белку. Так, например, на поверхности стекла имеются нескомпенсированные заряженные группы и потенциальные доноры и акцепторы водородных связей. Поэтому некоторые материалы, из которых изготовляют реакторы (в частности, стекло), способны сорбировать на своей поверхности ферменты за счет образования слабых нековалентных взаимодействий. Это приводит к уменьшению концентрации фермента в растворе, т. е. к кажущейся инактивации. [c.125]

Для расчета констант скорости из данных стационарной кинетики и определения стехиометрии связывания необходимо знать концентрацию активных центров ферментов. Рассчитать эту величину исходя из молекулярного веса белка и его концентрации нельзя, поскольку не всегда удается выделить абсолютно чистый фермент. Проблема определения концентрации была решена путем применения метода титрования активных центров и сочетанием исследования ферментативных реакций в стационарных и предстационарных условиях, позволяющих связать концентрацию активной формы фермента с начальным всплеском концентрации продукта. Начальный всплеск наблюдается в тех случаях, когда по ходу реакции происходит накопление связанного с ферментом промежуточного соединения. Первый моль субстрата быстро реагирует с ферментом с образованием стехиометрических количеств фермент-содержащего промежуточного соединения и продукта, а дальше реакция замедляется, поскольку идет медленный распад промежуточного соединения с высвобождением свободного фермента [c.152]

Ряд реакций общего пути катаболизма зависит от концентрации адениловых нуклеотидов — АТФ, АДФ и АМФ. Суммарная концентрация адениловых нуклеотидов в клетке постоянна, но относительные концентрации могут изменяться вследствие их взаимопревращений. Во многих клетках концентрации АТФ, АДФ и АМФ относятся примерно как 100 10 1 (однако отметим, что это приближенная оценка, в клетках разных типов различия могут быть заметными). Отсюда следует, что небольшие изменения концентрации АТФ могут приводить к значительным изменениям концентрации АДФ и АМФ. Например, если Ую часть всей АТФ превратится в АДФ, то концентрация АДФ увеличится в 2 раза. Это имеет существенное значение, поскольку изменения активности аллостерических ферментов зависят не от абсолютной концентрации эффекторов, а от амплитуды изменения концентрации. [c.243]

В определенной окрестности / ер образование глюкозы может протекать в так называемом квазистационарном режиме, когда скорости образования и распада промежуточных метаболитов близки друг к другу в течение какого-то (иногда достаточно большого) промежутка времени, или, более строго, когда абсолютные величины скоростей образования и распада промежуточных соединений значительно превышают разность между ними. Это условие наиболее надежно выполняется, если концентрация исходного субстрата специально поддерживается постоянной в системе, что приводит к истинно стационарному режиму по промежуточным соединениям (когда их концентрации постоянны в течение достаточно продолжительного периода времени). В замкнутых реакционных системах уменьшение скорости конверсии исходного субстрата в конечный продукт становится заметным при временах, больших /пер именно за счет уменьшения скорости образования промежуточных соединений и их последующего превращения (если, разумеется, замыкающие ферменты в полиферментной цепи не находятся в насыщении промежуточными метаболитами). [c.132]

Существует большое количество веществ, взаимодействие которых с ферментом снижает активность такие вещества называют ингибиторами. Если фермент не абсолютно специфичен, то ингибитор, имеющий некоторое сходство с субстратом данного фермента, может вступать во взаимодействие с активной группой и блокировать ее. Это явление называется конкурентным торможением. Если же ингибитор совершенно иначе взаимодействует с ферментом, чем субстрат, то повышение концентрации субстрата не может привести к вытеснению ингибитора, и торможение [c.57]

Ферментативный гидролиз сахарозы существенно отличается от реакции, катализируемой кислотой. В своей классической работе 1902 года Браун [4] показал, что абсолютное количество сахарозы, гидролизуемое в единицу времени, не зависит от начальной концентрации сахарозы. Другими словами, оказалось, что реакция гидролиза имеет нулевой порядок по сахарозе. Интерпретация этого наблюдения, предложенная Брауном, послужила основой практически всех возникших в дальнейшем представлений о механизме действия фермента. Браун предположил, что фермент соединяется с сахарозой в комплекс, который затем расщепляется с образованием продуктов реакции и освобождением фермента. Полученные Брауном экспериментальные данные соответствуют тому, что должно происходить в такой системе, содержащей небольшое количество фермента и избыток сахарозы. Формальный механизм реакции может быть выражен схемой [c.38]

Na+K -АТФаза в жабрах рыб, адаптированных к соленой воде, обнаруживает абсолютную специфичность в отношении Na , и для ее активности, по крайней мере в физиологических условиях, абсолютно необходим К" . Изменение наружной концентрации К" резко изменяет скорость активного выведения Na+. Обмен происходит в соотношении lNa+ 1К и именно при таком соотношении концентраций наблюдается оптимальная активность. Таким образом, фермент представляет собой классическую АТФазу, зависимую как от Na, так и от К, тогда как [c.155]

Кинетика ферментативных реакций при условии 1Е1о [8]о. Определение абсолютной концентрации фермента из кинетических данных [c.114]

Белковый характер ферментов. Выше уже отмечалось, каким путем были получены водные экстракты, соки или даже твердые аморфные осадки, содержащие различные ферменты. До выделения чистых ферментов невозможно было оценить концентрацию фермента в этих сырых ферментативных препаратах. Однако на этом этапе исследований удалось получить в результате различных операций очистки препараты, в тысячу раз более активные, чем исходные тем самым было доказано, что ферменты являются, как правило, крайне активными катализаторами, действующими дан е в очень малых концентрациях. Этот результат не давал, естественно, никаких указаний в отношении абсолютной концентрации фермента. Среди методов очистки и концентрирования, примененных прежними исследователями, следует особо отметить метод, которым пользовались Вильштеттер и его ученики, очень сходный с современньш хроматографическим методом, а именно адсорбцию на таких твердых материалах, как каолин или окись алюминия, и последующее элюирование солевыми растворами. Эти исследования показали, что ферменты имеют коллоидный (на современном языке макромолекулярный) характер, но они не позволили уточнить их химический характер. [c.792]

Эти уравнения не могут быть проверены непосредственно, ввиду того что, как правило, не известна абсолютная концентрация фермента. Все же оказалось возможным развить кинетические методы, позволяющие определить константу равновесия К уравнения (1), а также максимальную предельную скорость, к которой стремится скорость реакции при больших концентрациях субстрата (Б. Чэнс, 1951 г. X. Гутфрейнд, 1955 г.). Полное совпадение между теорией и опытом является доказательством в пользу существования лабильных соединений фермент — субстрат. При высокой концентрации субстрата равновесие (1) полностью смещено вправо, поэтому возрастание концентрации субстрата уже не может увеличить скорость реакции, ввиду того что в единицу времени не могут связываться несколько молекул фермента и субстрата. Таким образом, реакция отвечает нулевому порядку. Когда же концентрация субстрата мала, равновесие смещено влево, и реакция отвечает первому порядку по отношению к субстрату. [c.798]

Характерной особенностью ферментов является специфичность их действия. Каждый фермент действует на строго определенный субстрат. Специфичность бывает абсолютная, когда фермент действует на один субстрат (уреаза), групповая— когда фермент действует на ряд соединений с определенными атомными группировками (липаза), а также стереохими-ческая — когда фермент действует на определенные стереоизомеры (р-глюкозооксидаза). Активность ферментов в клетке строго регулируется. Процесс биосинтеза ферментов находится под генетическим контролем. Активность ферментов регулируется концентрацией конечных и промежуточных продуктов превращения субстрата, а также условиями окружающей среды. [c.82]

Следует сказать, что вообще этот способ выражения для количества фермента нельзя считать совершенным. Как ясно из определения, он основан на измерении скорости катализируемой ферментом реакции. Однако эта скорость зависит не только от указанных выше условий, но также (как это будет показано ниже) от концентрации и активности фермента, ионной силы раствора и многих других факторов. Таким образом, наиболее правильной мерой абсолютного количества фермента должно быть число гмолей его или, нри неэквивалентности их числу каталитических центров, условное число гмолей активных центров гмоли фермента, деленные на число активных центров в молекуле). Разумеется, такой способ выражения будет находить все большее применение по мере получения индивидуальных ферментов и определения их молекулярного веса, а также концентрации активных центров. [c.10]

Наконец хотелось бы сказать о значении сравнительно просто определяемой максимальной скорости ферментативной реакции в исследовании некоторых вопросов механизма действия ферментов. Поскольку максимальная скорость ряда реакций, катализируемых одним и тем же ферментом, при сохранении постоянной концентрации фермента и условий реакции определяется значением констант k+2, то появляется возможность на основании. сопоставления V при [ ]о = onst исследовать относительные изменения e+2 (без вычисления их абсолютных значений). Например, если имеются две реакции, катализируемые одним и тем же ферментом, но в которых превращению подвергаются два разных субстрата (8(1) и 8(2)) [c.58]

Удобство метода состоит также в том, что он позволяет осуществлять микро- и ультрамикроизмерения активности холинэстераз, причем, как показывает опыт, микромодификации метода дают даже ббльшую точность, чем макрометод. Дело в том, что, при работе с малыми объемами можно создать сравнительно большие концентрации фермента при малых абсолютных количествах их, а это, в СБОЮ очередь приводит к относительно большим сдвигам pH при реакции, что повышает точность определения. Трудности работы микро- и ультрамикрометодами носят чисто технический характер. Величина общего объема реакционной смеси лимитируется конструкцией и размерами сосудика, где должны быть размещены стеклянный электрод, электрод сравнения, мешалка и кончик бюретки для щелочи. При объеме реакционного сосуда 3—Ъмл могут быть использованы двухстенные сосудики с протоком воды от выносного ультратермостата, обычного размера стеклянный и каломельный электроды, а также магнитная мешалка. При работе с реакционными смесями объемом 0,5—0,7 мл необходим маленький сосудик также с двойными стенками (для тер статирования), в котором размещается стеклянный электрод с шариком диаметром 2,5— [c.150]

Для оценки активности конкретного препарата пользуются такими понятиями как удельная или молекулярная активность. В первом случае это — активность в расчете на единицу веса всего препарата или белка в нем во втором —в расчете на одну молекулу фермента. Выражают обычно удельную активность числом единиц на 1 мг белка, а концентрацию фермента в растворе— числом единиц в 1 мл. Молекулярной активностью называют число единиц в 1 мкмоль чистого фермента, равное числу молекул субстрата, которое одна молекула катализатора превращает за 1 мин. Если возможно измерить абсолютную концентрацию каталитически активного центра или простетической группы, то. можно высчитать активность каталического центра. Она определяется количеством молекул субстрата, которое один центр превращает за минуту. [c.45]

В заключение отметим еще два свойства сопряженных систем. Точное соотношение констант скорости и концентраций ферментов позволяет ферментным системам оперировать весьма неустойчивыми промежуточными соединениями, стационарная концентрация которых может быть весьма незначительной. Тем же целям служит структурная организация ферментов in vivo, в соответствии с которой даже весьма малые абсолютные количества ключевых промежуточных соединений могут создавать эффективные локальные концентрации. [c.250]

Таким образом, смертельные дозы серной кислоты возрастают значительно медленнее, чем концентрация фенолазы для 0.5 мг фенолазы она составляет 33-кратное, для 30 мг только 5-кратное от количества фермента. Если принять во внимание, что превращение, обусловленное фенолазой, возрастает также медленнее, чем концентрация фермента, то оказывается, что смертельные дозы серной кислоты пропорциональны не абсолютным количествам фенолазы, а только активности фермента при данных копцентрациях. [c.449]

IV. При возрастающих концентрациях фенолазы и постоянном количестве субстрата смертельные дозы кислоты пропо1)циональны не абсолютным количествам фермента, а атгтивности фенолазы при данных отношениях концентрации. [c.451]

По современным представлениям, Ма , К -АТФаза является типичным липидзависимым ферментом для формирования его функционально-активной конформации необходимы кислые липиды. Показано, что мембранные гликолипиды, локализованные преимущественно в наружной половине бислоя, обеспечивают правильную ориентацию Ма , К -АТФазного комплекса относительно плоскости мембраны (т.е. они отвечают за проявление векторных свойств фермента). Вместе с тем остается неясным, какова специфическая роль мембранных фосфолипидов в обеспечении транспортной функции Ма, К -АТФазы. По-видимому, функционирование центров связывания нуклеотидов и катионов на молекуле фермента не зависит от липидов, тогда как для осуществления конформационных перестроек в ферментном белке важна его связь с мембранными липидами. Кривые, описывающие зависимость ферментативной активности от концентрации липида, имеют сигмоидную форму, что свидетельствует о кооперативном характере связывания липидов с белком. Однако абсолютная потребность фермента в тех или иных фосфолипидах (или их полярных головках) экспериментально не доказана. Так, опыты по ферментативному превращению одних фосфолипидов в другие (например, фосфатидилсерина в фосфатидилэтаноламин) в препаратах мембраносвязанной Ка" , К+-АТФазы показали, что фермент может функционировать без отрицательно заряженных фосфолипидов, но с уменьшением молекулярной активности. [c.92]

Изменения аффинности и емкости Р -(6-аминогексил)-Р -(5 -аденозин) пирофосфат — сефарозы при разбавлении разными количествами немодифицированной сефарозы на примере взаимодействия с миокиназой хорошо видны в табл. 5.2 [8]. Разбавление аффинным сорбентом ведет к уменьшению связываемости р, выраженной через концсптрацпн хлорида калия, которые необходимы для элюирования фермента. Емкость сорбента, выраженная в единицах активности фермента, сорбированного па 1 мкмоль нуклеотида, возрастает при низких концентрациях нуклеотида, хотя абсолютная емкость на 1 г материала колонки с разбавлением уменьшается. [c.78]

Енолаза — фермент, катализирующий реакцию (XI.И),— распространена очень широко. Для ее действия абсолютно необходимы двухвалентные катионы (Мп +, Mg , Zn + или d +), антагонистами которых могут быть другие катионы (Са или Sr +). Ион F является эффективным ингибитором при низкой концентрации (10 М), особенно в присутствии Фн, что, вероятно, следует приписать образованию метафторфосфата, связанного с активным центром фермента. [c.290]

Действительное количество фермента, присутствующего в любой данный момент времени, определяется относительными скоростями его синтеза и распада, а также концентрациями различного рода ингибиторов и активаторов. Как правило, распад ферментов протекает медленно и не известно ни одного специального примера, когда содержание фермента регулировалось бы его распадом. В то же время показано, что существует высокоспецифичная регуляция синтеза ферментов, осуществляемая за счет гормональных механизмов, механизма репрессии и дерепрессии (индукции), а также других пока еще недостаточно изученных процессов. Такая регуляция синтеза ферментов мол ет быть абсолютно по спе ,ифичности, но осуществляется она медленно. У бактерий для значительных изменений содержан 1я фермента таким путем необходимы минуты, а у высших растений— часы. [c.16]

Очевидно, что необходима тесная корреляция между м(ха+) концентрациями Na+, при которых функционирует транспортный фермент. Высокие значения K ( + , свойственные транспортным системам беспозвоночных — обитателей открытого моря, просто не годятся для солоноватоводных и пресноводных местообитаний. Как видно из их кривых насыщения, приведенных на рис. 48, если транспортную систему с низким сродством к Na+ поместить в среду с низкой концентрацией Na , то как абсолютная скорость переноса, так и реакция на обычные изменения в концентрации Гча будут крайне незначительными. Иными словами, для того чтобы вызвать даже небольшое [c.146]