Ионизация тирозина

Для обнаружения ароматических и гетероциклических а-ал нокислот используется ксантопротеиновая реакция (реакция фенилаланин, тирозин, гистидин, триптофан). Например, п действии концентрированной азотной кислотой на тирозин ( разуется нитросоединение, окрашенное в желтый цвет. При j бавлении к нему щелочи окраска становится оранжевой в Bf ионизацией фенольной гидроксильной группы и увеличени вклада аниона в сопряжение. [c.336]

Из анализа этих данных следует, что в каталитическом акте принимает участие группировка с рКь 6,48, которая при образовании комплекса Михаэлиса теряет способность к ионизации, но освобождается после отщепления холина. Аналогично ведет себя вторая группировка активного центра, имеющая в исходном ферменте рКа 9,35. Величине рК основной группы наиболее близка к значению рК имидазольной группы гистидина. Кислотная группа с рК 9,35 может представлять ОН-группу тирозина, либо 5Н-группу цистеина. Таким образом, из данных Лейдлера и Крупки следует, что рк тех же группировок в ацетилированном ферменте отличается от значений рК в исходном ферменте. [c.183]

На рис. 1 показано два типа остатков тирозина в трипсине [6]. Кривые бив, снятые сразу и спустя 3 ч после добавления щелочи, свидетельствуют о мгновенной ионизации при pH 10,0 (т = 1) 6 остатков тирозина из 10 и медленной ионизации оставшихся 4 остатков при pH выше 11,4. Кривая д, полученная путем вычитания кривых в п г, дает для этих медленно ионизующих остатков значение рК = 10,8 (т = 2). После денатурации трипсина 3,2 М гуанидином все 10 остатков характеризуются рК [c.347]

Параметры ионизации остатков тирозина в белках приводятся в ряде работ [1—4, 6—19, 57, 62, 64—66 . Эти данные [c.347]

РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ И ПАРАМЕТРЫ ИОНИЗАЦИИ ОСТАТКОВ ТИРОЗИНА В БЕЛКАХ [c.348]

Сведены в обл. 1, где щ означает общее число остатков тирозина в молекуле белка, ап, — число возможных состояний, т. е. остатков, характеризующихся различной реакционной способностью или параметрами ионизации. [c.351]

Спектрофотометрический анализ применим в этих двух случаях потому, что в каждом из них изменение характера поглощения в ультрафиолетовой области спектра обусловлено ионизацией только одной из групп (сульфгидрильной в цистеине или фенольной в тирозине). [c.92]

Мы описали три возможные причины появления аномальных значений рКа, находимых из кривых титрования. На практике, однако, часто бывает очень трудно разделить эти три эффекта, и приходится прибегать к данным о теплоте реакции, энтропии и изменении свободной энергии. Если экспериментальная кривая титрования отличается от кривой, построенной в соответствии с уравнением (V. 4), в котором учтен заряд молекулы, то это можно объяснить либо влиянием гидрофобного ядра, либо возникновением водородных связей молекулы. Эти два случая особенно трудно различимы, так как они часто дают эффект одного знака. Ионизация кислотной группы, находящейся в гидрофобном ядре молекулы, будет протекать при более высоких значениях pH, чем обычно, как из-за пониженного значения диэлектрической проницаемости, так и вследствие образования водородных связей. Аномальную ионизацию белков чаще всего объясняют образованием водородных связей. В последнее время усиленно подчеркивается влияние неполярного гидрофобного ядра. Аномальные кривые часто наблюдаются при титровании карбоновых групп кислот или фенольной группы тирозина — как раз тех групп, которые, как уже было показано, наиболее чувствительны к понижению диэлектрической проницаемости окружающей среды. Если аномальную ионизацию аммонийных групп не удается объяснить наличием заряда молекулы, то весьма вероятно, что она вызывается образованием водородной связи. [c.109]

Наконец, по возрастанию поглощения света в области 295 ммк, сопутствующему ионизации фенольных групп, было определено число остатков тирозина, которое оказалось равным 6, При pH 7,5 происходит изменение конформации макромолекулы, и две карбоксильные группы, скрытые до того внутри глобулы, становятся обратимо титруемыми. Всего в р-лактоглобулине найдено 53 карбоксильные группы. Таким образом, методом титрования могут быть изучены некоторые структурные особенности и переходы в белке. При рН>9,7 белок необратимо денатурирует. При низких значениях pH он диссоциирует на две субъединицы с молекулярным весом около 18 000 каждая. Результаты титрования согласуются с данными аминокислотного анализа белка, проведенного с помощью стандартных методов, с точностью до одного аминокислотного остатка. [c.115]

Аналитические данные показывают, что яичный альбумин содержит около 9 остатков тирозина, обнаружить которые титрованием не удается. Благодаря тому что белки, имеющие изо-электрическую точку в кислой области, в щелочных растворах приобретают большой отрицательный заряд, характерное для фенольных групп значение р ш—Ю может измениться под влиянием электростатических эффектов до рк 2. Ионизацию фенольных групп можно установить спектральным методом, так как известно, что при 295 ммк заметно поглощает только анионная форма остатков тирозина. В яичном альбумине до рН>12,5 роста поглощения, характерного для анионной формы фенольных групп, не наблюдается, а затем оно наступает быстро и необратимо. Если затем снизите значение pH, то конформация белковой молекулы оказывается отличной от исходной. Необратимую денатурацию вызывает также нагревание и добавление сильной кислоты или концентрированного раствора мочевины. [c.117]

Поскольку поглощение белков в области 250—300 ммк обусловлено остатками триптофана, тирозина и фенилаланина, изменение поглощения в этой области связано, по-видимому, с влиянием, которое оказывает на хромофоры изменение условий в молекуле белка. Эксперименты с индолом, фенолом и бензолом— соединениями, которые можно рассматривать как модели этих остатков, — показывают, что при увеличении показателя преломления растворителя наблюдается сдвиг в область длинных волн (в данном случае речь идет не о красном сдвиге к 295 ммк, обусловленном ионизацией фенольной группы). Для неполярных растворителей этот сдвиг можно объяснить и оценить количественно. В водных растворах направление сдвига остается тем же, однако описать его простой формулой не удается. Для этого необходимо оценить, в какой мере растворитель может стабилизировать основное и возбужденное состояния хромофорных групп. Сдвиг в голубую область спектра, наблюдаемый при разрушении структуры белка, можно объяснить качественно, если предположить, что хромофорные группы перемещаются при этом из гидрофобной среды в белковой матрице в водную среду, показатель преломления которой меньше. Разностные спектры служат чувствительным показателем нарушений в третичной структуре, которым обычно сопутствуют изменения оптического вращения, вязкости и т. д. В некоторых случаях большое изменение теплоты и энтропии наблюдается при условиях, когда, судя по измерениям оптического вращения, изменений во вторичной структуре не происходит. В таких случаях разностные ультрафиолетовые спектры могут служить дополнительным критерием наличия изменений в третичной структуре. Можно ожидать также изменений в спектре, обусловленных изменением величины заряда вблизи хромофора. Однако эксперименты с модельными соединениями показывают, что подобные изменения могут происходить только в том случае, если [c.299]

Исследование диссоциации фенольных гидроксилов тирозина и сульфгидрильных групп цистеина в белках производится также спектроскопическим путем — методом спектрофотометрического титрования. При этом используется зависимость ультрафиолетового спектра поглощения этих остатков от состояния их ионизации. Степень ионизации при заданном значении pH определяется из соотношения [c.28]

Более того, поскольку эти группировки характеризуются различными значениями теплот ионизации (эти значения приведены на фиг. 22 в скобках) и различной чувствительностью величин р/С к изменениям ионной силы и диэлектрической проницаемости, широкое исследование рН-функций позволяет получить достаточно экспериментальных данных для идентификации активных групп фермента. Так, например, значение р/С5 свидетельствует о том, что в механизме действия фермента участвует сильно ионизированная карбоксильная группа или слабо ионизированный ион имидазолия. Чтобы произвести выбор между этими группировками, нужно изучить температурную зависимость р/С, так как теплоты ионизации этих двух групп существенно отличаются друг оТ друга. Другой пример р/СЮ,5 может относиться либо к е-аминогруппе лизина, либо к фенольному гидроксилу тирозина эти группировки можно дифференцировать, исследуя влияние ионной силы, поскольку величина р/С гидроксила (и карбоксила) в отличие от р/С аммониевой группировки весьма чувствительна к этому параметру. [c.214]

Методами потенциометрического и спектрофотометрического титрования обеих форм карбоангидразы человека [69, 70] и изофермента В быка [71] были получены детальные кривые титрования в области ионизации гидроксильной группы тирозина. При кислотном титровании карбоангидразы В человека наблюдается скачок при pH 4,0—4,2, соответствующий поглощению 7 протонов на [c.571]

НЫХ значениях pH обнаружены полосы поглощения при 295 нм, которые очень похожи на полосы в спектре п-ацетил-ь-тирозина при pH 10,8 по сравнению с его спектром при pH 7, т. е. на полосы ионизированной фенольной ОН-группы в сравнении с неионизиро-ванной [64]. Таким образом, различия в спектрах белков объясняются ионизацией тирозина. Молярный коэффициент поглощения дифференциальной полосы можно получить из спектра поглощения полностью денатурированного щелочью белка по сравнению со спектром нативного белка, приняв во внимание число тирозильных остатков в молекуле или из измерений, выполненных на модельных соединениях. Существуют некоторые расхождения между значениями, полученными дифференциальным методом, и значениями, сообщенными для различных белков, и эти расхождения трудно объяснить [64, 76]. Кроме того, значение молярного коэффициента поглощения, сообщенное для случая щелочной денатурации, возможно, нельзя прямо применять к измерениям на нативном белке [76]. По-видимому, изменения, наблюдаемые при связывании металла с сидерофилинами, действительно, связаны с изменениями в тирозильных остатках, несмотря на то, что не существует зависимости от числа этих остатков в молекуле белка. Тан и Вудворт [c.347]

Содержащиеся в радикалах ,а-аминокислот другие ноногенньк группы способны к ионизации при различных значениях pH Например, фенольная гидроксильная группа в тирозине ионизи рована при pH 10,1 тиольная группа в цистеине — при pH 8,1 — 8,3 и т. д. В целом ни одна а-аминокислота in vivo не находится t своей изоэлектрической точке и не попадает в состояние, отве чающее наименьшей растворимости в воде. Таким образов а-аминокислоты в организме находятся в ионной форме. [c.330]

Спектрофотометрическое обнаружение белков и пептидов в растворах заключается в измерении поглощения при длине волны, соответствующей максимальному поглощению. Большинство белков содержит остатки тирозина, фенилаланина и в меньшей степени остатки триптофана, характеризующиеся максимумом поглощения в коротковолновой части спектра. В этой же части спектра располагаются полосы поглощения, характерные для пептидной связи, а-спирали пептидной цепи, дисульфидных связей, остатков цистина и др. На практике наибольший интерес представляет широкая полоса поглощения в области 275— 280 нм, характерная для остатков тирозина и триптофана. Поглощение белков в области выше 280 нм сильно зависит от pH среды, что связано с ионизацией гидроксильных групп остатков тирозина в сильнощелбчной среде, вызывающей изменение коэффициента экстинкции и сдвиг максимума поглощения в более длинноволновую часть спектра. Изменение коэффициента экстинкции тирозина в зависимости от pH среды приведено в табл. 35.7. [c.456]

Начиная с первых опытов Краммера и Нойбергера [5] спе рофотометрическое титрование применяют для выявления стояния остатков тирозина. Свободный тирозин в нейтраль среде ионизуется при добавлении щелочи мгновенно рК сиг идальной кривой ионизации первого порядка (т = 1) сост ляет 10,0 0,01. Эти характеристики не изменяются в прж ствии такого денатурирующего агента,как гуанидин[1]. Оста [c.346]

Цианурфторид (20] реагирует с тирозином и боковыми цепями некоторых аминокислот, например с амино- и сульфгидрильными группами, но не взаимодействует с другими ароматическими аминокислотами. После реакции с цианурфторидом полоса поглощения тирозина в УФ-области исчезает. Цианурфторид устойчив в диоксане, но медленно гидролизуется в воде с образованием циануровой кислоты. Ни циануровая кислота, ни продукты реакции с аминокислотами не поглощают в области выше 290 нм. При взаимодействии ЦФ с белком оба процесса, гидролиз реагента и реакция с остатками аминокислот, включая тирозин, идут одновременно. Оптимальная область pH для модификации остатков тирозина составляет 9,0—12,6. Продукт реакции с аминогруппой гидролизуется до свободной кислоты при обычном кислотном гидролизе. Степень замещения можно определять дифференциальной спектрофотометрией в сравнении с иитактным тирозином, не модифицированным ЦФ. Для этого реакционную смесь разделяют на две части в одной половине поддерживают нейтральное pH, другую подщелачивают до 12,6. Разница в поглощении между двумя растворами позволяет рассчитать концентрацию тирозина. Добавление гуанидина способствует полной ионизации некоторых маскированных остатков тирозина. [c.351]

Полоса поглощения 360 нм (s=2790 М- см ) неионизован-ной формы N-ацетил-З-нитротирозина смещается в слабо кислой среде в область 427 нм (е = 4100 М см" ), становясь при ионизации более интенсивной (рК = 7,0) изобестическая точка находится при 381 нм (б = 2200 М см" ). При обработке карбоксипептидазы 64-кратным молярным избытком ТНМ нитруются 6,7—7,1 из 19 остатков тирозина. Однако при 4-кратном молярном избытке нитрование идет лишь по одному остатку, при этом пептидазная активность снижается до 10%, а эстеразная возрастает до 170% [49]. При действии ТНМ в присутствии р-фенил-пропионата, ингибитора карбоксипептидазы, ферментативная активность не изменяется. На основании этого было сделано предположение об участии остатка тирозина в работе активного центра. [c.354]

Полосы поглощения в УФ-области остатков триптофана, тирозина и фенилаланина сами по себе могут дать информацию относительно их непосредственного окружения. В зависимости от окружения может наблюдаться смещение максимума полос поглощения или изменение интенсивности. Ветлауфер и сотр. [256], а также Донован [257] и сотр. исследовали влияние заряда вследствие ионизации карбоксила, протонирования аминогруппы или других факторов на УФ-спектры ароматических аминокислот. Бигелов с сотр. [258, 259] изучали влияние растворителей и состава раствора. [c.375]

Вторую группу составляют методы, не требующие предварительного синтеза конкретных модельных соединений. Однако обязательным условием применения этих методов является наличие такой области в спектре, где бы изменение происходило только вследствие ионизации одной из групп. Для этого кислотно-основные центры не должны входить в единую сопряженную систему и должны быть достаточно удалены друг от друга. Это условие часто выполняется для алифатических соединений. Например, в области около 300 нм спектр поглощения тирозина HO 6H4GH2 H( OO )NH+з зависит только от того, ионизирована или не ионизирована оксигруппа, и совершенно не зависит от ионизации аммониевой группы [115]. (В исследуемой области pH карбоксильная группа полностью ионизирована.) Фактически это означает, что за модель одной промежуточной формы можно принять НАН, а за модель другой промежуточной формы — А. [c.181]

Такое поведение характерно для имидазольной или аминогруппы, но не для тнрозинового или серинового гидрокспла. Теплота ионизации группы, принимающей частие в лимитирующей стадии, составляет 7 ккал/моль для трипсина [74а] и 11 ккал/моль для а-химотрипсина [53]. Величина ЛЯ для имнд-азольной группы гистидина в белках равна 6,9—7,5 ккал/моль, а для фенольной группы тирозина - 6,0 ккал/моль. Естественно, необходимо учитывать то обстоятельство, что, если механизм реакции включает предравновесные стадии или конформацион-ные превращения, предшествующие лимитирующей стадии, то величина ЛЯкаж не обязательно должна быть идентичной ЛЯ . [c.258]

Многие интересные и важные свойства белков объясняются тем, что белки содержат большое число ионизирующихся групп, в результате чего они почти при всех условиях являются полиэлектролитами. В ионизации у таствуют главным образом боковые цепи глутаминовой и аспарагиновой кислот, лизина, гистидина, аргинина, цистеина и тирозина (см. табл. 8). Что касается а-аминогрупп и а-карбоксильных групп аминокислот, составляющих молекулу белка, то их ионизация не имеет существенного значения, так как подавляющее большинство этих групп участвует в образовании пептидных связей. [c.70]

НО с коричной кислотой и тирозином результаты оказались отрицательными. Полимеры охарактеризовали по дифференциальным спектрам ионизации, гистохимическим тестам на лигнин, растворимости и по наличию свободных фенольных групп, после этого их сравнили с лигнином, экстрагированным из созревших растений этого вида. Оказалось, что полимер из феруловой кислоты очень сильно напоминает натуральный лигнин, и это еще более подтвердило гипотезу о том, что in vivo это соединение является хорошим предшественником лигнина. Стаффорд предположил, что отличие результатов, полученных с коричной кислотой и тирозином, от результатов Брауна и Нейша [30] может быть следствием или медленного превращения этих соединений в п-оксикоричную кислоту, или ингибирования перекисью ферментативных реакций, или использования субстратов в конкурентных реакциях. [c.293]

Спектрофотометрический метод особенно ценен в тех случаях, когда необходимо различить присутствующие в растворе группы с очень близкими значениями константы диссоциации, причем только диссоциация групп одного определенного типа приводит к изменению спектра поглощения. Этим методом удалось различить диссоциацию аммонийной и сульфгидрильной групп (в цистеине) обе они диссоциируют при одинаковых значениях pH, но только диссоциация SH-rpynn влечет за собой изменение поглощения. Аналогичным образом можно отличить диссоциацию аммонийной группы от диссоциации в фенольной группе тирозина и найти каждую из констант, используя тот факт, что к заметному изменению поглощения приводит только диссоциация в фенольной группе. Позднее мы увидим, как с помощью этого метода удается проследить за ионизацией определенных групп в белках, несмотря на то что при тех же значениях pH ионизируются также и другие группы. [c.81]

У глицина отношение числа биполярных молекул к числу незаряженных молекул очень велико. Ионизация карбоксильной группы глицин-катиона начинается практически до того, как происходит отщепление протона от группы МН .Это характерно и для других аминокислот. Но если радикал К аминокислот содержит какие-либо дополнительные кислотные и основные группы, ионизация приобретает более сложный, конкурентный характер. Одновременную ионизацию двух карбоксильных групп глутаминовой кислоты можно дифференцированно определить путем сравнения констант ионизации ее обоих моноэфиров с константой ионизации самой кислоты. Такой метод применим и при анализе одновременной ионизации аминной и сульфгидрильной групп цистеина, а также аминной и фенольной групп тирозина. Ионизация карбоксильных групп этих соединений начинается до того, как она проявляется в заметной степени в остальных [c.91]

Изучение трех сополимеров тирозина показало, что, как и следовало ожидать, при возрастании положительного заряда молекулы (введение в сополимер L-лизина) кривая титрования смещается в сторону меньших значений pH (ср. кривые II и III на фиг. 14). Наоборот, поскольку отрицательный заряд остатка аспарагиновой кислоты затрудняет ионизацию фенольной группы тирозина, кривая титрования соответствующего сополимера (/) смещена в сторону более высоких значений pH. Для этой кривой p int также равно 9,5, но 6=15,4 А, т. е. молекула имеет меньшие размеры. Для сополимера тирозина с аланином параметр со не остается постоянным, а уменьшается с возрастанием а предполагается, что это происходит вследствие гибкости цепочки и ее растяжения при возрастании свободного заряда. Исследование сополимера тирозина с лизином позволило получить новые данные, так как остатки тирозина и лизина ионизуются (теряют протон) в одном и том же интервале значений pH, но в то время как e-NHs"-группа лизина становится нейтральной, фенольная приобретает отрицательный заряд. В результате на кривой титрования этого сополимера вблизи изоэлектрической точки, где Z = Q, наблюдается перепад. Это свидетельствует о том, что компактная молекула, содержащая равное число положительных и отрицательных зарядов, растягивается, как только заряды одного знака получают перевес (т. е. по обе стороны от изоэлектрической точки), вследствие отталкивания одноименных зарядов. Отметим также, что в той области значений pH, где остатки лизина незаряжены, а фенольные группы почти все несут отрицательный заряд, кривые II и III совпадают. [c.111]

Остатки тирозина, обладающие малым сродством к воде, очевидно, находятся во внутренней гидрофобной части макромолекулы (отличающейся низкой диэлектрической проницаемостью) и потому слабо поддаются ионизации. Источником дополнительной стабилизации для некоторых групп могут служить водородные связи. Подобного рода замаскированные группы наблюдаются и в других белках это относится также и к сульфгид-рильным группам цистеина. [c.118]

Белки обладают, по существу, теми же ионными группами, что и аминокислоты. Однако в белке большинство сс-аминогрупп и с -карбоксильных групп связаны друг с другом пептидными связями. Кислые группы белков представлены главным образом свободными карбоксильными группами аспарагиновой и глутаминовой кислот, ионизация которых соответствует рК 3,87 и 4,28 (табл. 7). К основным группам белков относятся гуанидиновые группы аргинина (рК 12,48) и е-аминогруппы лизина (рК 10,53). Гидроксильные группы тирозина и сульфгидрильные группы цистеина отдают свои протоны в одной и той же области pH (рК около 10), в то время как имидазольные группы гистидина титруются вблизи pH 6 (табл. 7). [c.81]

Влияние pH на ферментативную активность иногда можно объяснить в рамках модели, предполагающей, что катализ зависит от состояния ионизации некоторых аминокислот. Тогда, если зависимость кат//См от pH описывается колоколообразной кривой, по ней можно определить константы ионизации Ки и К е каталитически важных групп в свободном ферменте. Константы ионизации, относящиеся к комплексу Е5, можно получить из зависимости кат от pH [101]. В случае КПА определение величин К е и Кге было бы полезным для установления роли тирозина и других остатков, расположенных вблизи субстрата. Однако имеющиеся данные довольно скудны. Пептидный субстрат КБЗ-01у-01у-РЬе был исследован недавно в условиях, при которых интерпретация результатов не осложняется ингибированием или активацией [7]. Кривые зависимости кат/-/См от pH оказались колоколообразными, что предполагает участие в катализе как кислой, так и основной групп. Кривые, описывающие влияние pH на кат, для этого субстрата имеют точку перегиба около pH 6. В щелочной области (до pH 10,5) кат практически постоянна . Отсутствие данных, указывающих на титрование второй группы в комплексе Е5, не исключает возможности участия в реакции кислотного катализа, если предположить, например, что соответствующая стадия не лимитирует скорость реакции (ср., однако, работу [103]). Зависимость гидролиза КГФ от pH представлена в нескольких ранних работах. Данные, полученные при высокой концентрации субстрата, указывают на с./южный характер влияния pH на кат и [26]. По зависимости начальной скорости от pH [104] были определены величины р/Се51 равные 6,5 и 8,6, однако сравнение с ацилтрипептидами показывает, что эти данные нуждаются в уточнении. При более низкой концентрации КГФ влияние pH на кат менее выражено [85]. [c.536]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология