Рибонуклеаза дисульфидные группы

Структура рибонуклеазы. После того как Сэнгер разработал методы определения последовательности расположения аминокислот в белковой молекуле, другие исследователи также приступили к изучению более крупных молекул белка. Мур и Штейн и их сотрудники в 1960 году определили строение фермента рибонуклеазы. Этот белок с молекулярным весом 13 700 содержит 124 аминокислотных остатка в одной цепочке. Свернутая кольцом цепочка соединена в четырех местах дисульфидными группами цистина так, как эт показано на рис. 218. Последовательность аминокислот была определена и для некоторых полипептидов, обладающих свойствами гормонов был изучен также белок вируса табачной мозаики, содержащий 158 аминокислотных остатков. [c.319]

Наличие поперечных химических связей в белках сообщает им специфические свойства, такие, как нерастворимость, меньшая способность к набуханию под действием полярных растворителей и повышенная прочность в мокром состоянии. В небольших молекулах таких биологически активных белков, как инсулин и рибонуклеаза, поперечные дисульфидные мостики оказываются необходимыми для проявления этими белками биологической активности. При этом дисульфидные поперечные связи не участвуют непосредственно в биохимических процессах, а функции их заключаются в сохранении в неизменном состоянии такой конформации молекул белка, которая необходима для проявления биологической активности. Модификация дисульфидных поперечных связей шерсти, а также введение в нее новых поперечных связей часто придают новые интересные свойства этому белку. Такими свойствами могут быть повышение прочности на разрыв, уменьшение способности к свой-лачиванию, увеличение устойчивости к агрессивным химическим реагентам (щелочи, кислоты, окислители или восстановители), повышение устойчивости к моли и износостойкости, а также повышение прочности окрашивания. Было показано, что дубление коллагена, необходимое для превращения сырья в технический продукт, также является процессом образования поперечных связей. Поскольку коллаген не содержит цистеина или цистина, в сшивании, протекающем при дублении, участвуют, по-видимому, другие группы, возможно аминные и гидроксильные. В настоящем разделе будут рассмотрены в первую очередь поперечные химические связи упоминавшихся выше классов белков. Шерсть — типичный кератин, являющийся одним из наиболее детально изученных в этом плане белков, дает интересные и наглядные примеры образования, расщепления и поведения как дисульфидных, так и вводимых искусственно поперечных химических связей другого типа. [c.395]

Как известно, функция рибонуклеазы состоит в гидролитическом расщеплении рибонуклеиновых кислот и олигонуклеотидов. Как мы видели, это один из первых белков, изучавшихся с помощью ЯМР, хотя спектры, полученные на ранних стадиях, не обнаруживали характерных деталей. Рибонуклеаза близка по размеру (молекулярная масса 13700, 124 аминокислотных остатка) и форме к лизоциму и является удобным объектом для изучения методом ЯМР. В ее молекуле имеются 4 дисульфидных мостика, 18 остатков основных аминокислот (10 Лиз, 4 Apr и 4 Гис) и только 10 остатков кислых аминокислот (5 Глу и 5 Асп). Таким образом, в растворе при нейтральных pH молекула заряжена положительно. По сравнению с лизоцимом она содержит несколько меньше а-спиральных структур и больше -структур (остатки 42—49, 71—92 и 94—110). В дополнение к 4 Гис имеются также 6 Тир и 3 Фен, но нет остатков триптофана. Полная трехмерная структура рибонуклеазы известна из рентгеноструктурных исследований, проведенных двумя группами авторов [37, 38, 38а]. Форма ее глобулы близка к сферической имеется большая щель, в которой происходит связывание субстрата. С одной стороны этой щели расположены в непосредственной близости друг от друга остатки Гис-12, Гис-119 и Лиз-7, а с другой стороны находится Лиз-41. По данным подробных химических исследований все эти четыре остатка входят в активный центр. [c.363]

Уменьшение размеров рибонуклеазы после разрыва 8—8-свя-зей и блокирования ацетамидными группами не вызывает сомнения. Эти результаты примечательны тем, что более плотная упаковка возникает после нарушения третичной структуры, после ликвидации удерживающих третичную структуру белка дисульфидных связей. Причем скручивание белка в плотную упаковку происходит не только за счет тирозин-карбоксильных водородных связей, но и в результате участия амидных группировок, без которых этого эффекта не наблюдается, хотя макромолекула и не развертывается существенным образом. Полученные данные объясняют полную реактивацию рибонуклеазы при реокислении, наблюдавшуюся Анфинсеном и другими [10]. Вместе с тем подобное явление не следует рассматривать как универсальное, так как в ряде белков разрушение 8—З-связей вызывает столь значительное разворачивание макромолекулы и увеличение ее размера, что воспроизведение нативной структуры при реокислении из-за [c.198]

То, что водородная связь образуется именно с карбоксильным ионом, а не с незаряженным карбоксилом, было доказано спектроскопически. При переходе от pH 1,5, когда СООН-группа не заряжена, к pH 5 происходит заметное смещение (на 6 ммк) полосы поглощения белка при 280 ммк, которое объясняется образованием водородной связи. Две такие связи были обнаружены в молекуле инсулина и три — в молекуле рибонуклеазы. Подобного рода связи играют важную роль в сохранении третичной структуры некоторых белков. Так, при обработке рибонуклеазы (5-меркаптоэтанолом в 8 М мочевине (агент, разрушающий водородные связи) происходили разрыв 5—5-мостиков и полная инактивация фермента. Однако после удаления этих агентов и окисления сульфгидрильных групп кислородом воздуха наблюдалось полное восстановление активности и числа 5—5-связей. Очевидно, что образование этих связей происходило в тех же местах, что и в нативном белке. Если же и окисление 5Н-группы проводилось в 8 М мочевине, то активность фермента не восстанавливалась, хотя и наблюдалось полное восстановление числа дисульфидных связей. Вероятно, восстановление этих связей проходило в полном беспорядке, хаотично, и белок остался денатурированным. [c.116]

Незначительные изменения конформации белка, например набухание молекул сывороточного альбумина при нодкислении раствора до pH 4 [384, 385], часто обратимы. Обратимость конформационных переходов особенно благоприятна в том случае, если полипептидная цепь имеет внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые накладывают ограничения на разворачивание цени. Наглядным примером такой обратимой денатурации является проведенное Германсом и Шерагой [395] исследование рибонуклеазы, молекула которой состоит из простой полипептидной цепи, сшитой четырьмя дисульфидными группами. Известна полная последовательность аминокислот в этом ферменте, и схематическое изображение полипептидной цени с указанием места поперечных связей [396] приведено на рис. 45. Отсюда возникает вопрос, можно ли разрушить поперечные связи путем восстановления, что позволяет цепи разворачиваться и возобновлять нативную конформацию с соответствующими нарами тиольных групп, окисленных до дисульфидных мостиков. Решающий эксперимент был поставлен Уайтом [397], который показал, что большая доля ферментативной активности, утерянная при восстановлении дисульфидных групп, может быть в основном восстановлена путем повторного окисления. Особенно важные результаты были получены Анфинсеном и др. [398], которые обнаружили, что воссоздание дисульфидных связей происходит быстрее, чем восстановление ферментативной активности белка. Так как восемь аминокислотных остатков, принимающих участие в создании четырех дисульфидных мостиков, могут соединяться друг с другом 105 различными способами и поскольку образование межмолекулярных дисульфидных связей влияет на ход внутримолекулярной реакции [399], образование многих поперечных связей в начальной стадии может протекать нерегулярно. Такие молекулы [c.137]

С другой стороны, каучук, вулканизированный серой, сохраняет свойства статистического клубка, несмотря на наличие ди- и полисуль-фидных мостиков. Изучение обратимой денатурации белков с разрывом и последующим спонтанным восстановлением первоначальных дисульфидных связей, прежде всего исследование К. Анфинсена [7] денатурации и ренатурации рибонуклеазы А, склоняет к предположению, что не 8-8-мостики создают нативную структуру, а, напротив, структура, формирующаяся за счет слабых взаимодействий, приводит к сближению вполне определенные остатки цистеина и тем самым обусловливает избирательное образование системы дисульфидных связей. Таким образом, можно заключить, что белковую глобулу создают слабые невалентные взаимодействия. Невалентные взаимодействия в водорастворимом белке мог) т возникать между пептидными группами основной цепи, между боковыми цепями аминокислотных остатков, между звеньями основной цепи и боковыми цепями. Кроме того, поскольку белок сохраняет свою нативную конформацию и функционирует только в водном растворе при определенных, так называемых физиологических значениях pH и ионной силы, то структура определяется также взаимодействиями белка с молекулами воды и находящимися в ней соединениями и ионами. Окружающая среда, помимо этого, оказывает конкурирующее и иное влияние на внутримолекулярные взаимодействия. Рассмотрим сложившееся мнение о природе перечисленных взаимодействий, об их вкладах в конформационную энергию и, следовательно, влиянии на стабильность пространственной структуры белковой молекулы. [c.232]

Доказать термодинамическую гипотезу свертывания очень трудно. Обычно полагают, что термодинамическая гипотеза подтверждается экспериментами по повторному свертыванию панкреатической рибонуклеазы [4351. В этих опытах восстановленная несвернутая рибонуклеаза повторно окислялась в присутствии 8 М мочевины причем образовывалась случайная система водородных связей. В результате получалось около 100 различных продуктов, каждый из которых характеризовался своим набором из 4 дисульфидных связей (возможны (2-4) /2 -4 = 105 систем связей S—S [436, 4371 кроме того, существуют различные теоретические возможности образования петель. Удаление мочевины и добавление меркаптоэтанола (рис. 4.3) приводило к постепенному и в конечном счете количественному образованию нативной структуры. Этот факт показывает, что исходя из 100 различных групп, находящихся в исходных конформациях, можно получить нативную структуру. Хотя это число и невелико, данный опыт свидетельствует об уникальности продукта свертывания, однако он не позволяет решить вопрос о локальном или глобальном минимуме. [c.182]

В молекуле нет дисульфидных мостиков. Известна последовательность аминокислот [47] и конформация цепи [48—51] миоглобина кашалота. Это был первый белок, структура которого определена с помощью рентгеноструктурного анализа. Он отличается от лизоцима и рибонуклеазы тем, что 121 аминокислотный остаток находится в а-спиральных участках [12]. Молекулу можно рассматривать как корзину, состоящую из восьми спиралей, которая содержит гем-группу внутри гидрофобной полости. Выступает на- [c.369]

Для объяснения других сил, удерживающих пептидные цепи, необходимо наглядно представить себе пространственную конфигурацию, которая называется третичной структурой. Третичная структура более жесткая и поддерживается связями различного характера между боковыми группами пептидных цепей. Наибольшее значение имеют дисульфидные связи — связи между двумя половинами остатка цистина. Предполагают, что существуют и другие связи — ионные, водородные и солевые [106], причем наличие некоторых из них было подтверждено экспериментально. Важность дисульфидных мостиков для придания жесткости третичной структуре доказана экспериментально и подтверждена блокированием функциональных групп. В дальнейшем это будет проиллюстрировано, в частности, в разделе, посвященном структуре рибонуклеазы. [c.385]

Первым белком, для которого была полностью определена последовательность аминокислот, является инсулин (за эту работу Ф. Сэнгер в 1958 г. получил Нобелевскую премию). Молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепей неравной длины, соединенных двумя дисульфидными поперечными связями —5—5— (фиг. 51). Вслед за инсулином была определена последовательность аминокислот в рибонуклеазе. Ее молекула представляет собой одну полипептидную цепь, удерживаемую в напряженной конформации четырьмя дисульфидными поперечными связями между восемью остатками цистеина. Число аминокислотных остатков в цепи равно 124. Ни в инсулине, ни в рибонуклеазе нет свободных —8Н-групп, так как все остатки цистеина в этих белках образуют поперечные 5—5-связи. [c.271]

Денатурация белка в классическом смысле определялась как любая непротеолитическая модификация уникальной структуры нативного белка, приводящая к определенным изменениям химических, физических и биологических свойств [388]. Из этого определения исключаются изменения состояния ионизации, если только они не сопровождаются конформационными переходами. Денатурация может происходить в результате нагревания, изменения pH и добавления неполярных растворителей или некоторых специфических денатурирующих реагентов, например мочевины или солей гуанидина. Она также может быть вызвана восстановительным или окислительным разрывом дисульфидных связей, которые стабилизуют нативные конформации некоторых белков. Денатурация, как правило, сопровождается уменьшением растворимости белка. Это можно легко понять, так как гидрофобное взаимодействие, стабилизующее нативную конформацию, приводит к межмолекулярной агрегации, если полипептидные цепи принимают вытянутые конформации. Другим характерным последствием денатурации является раскрытие реакционноспособных групп, которые расположены внутри третичной структуры и становятся доступны воздействию реагентов при разрушении этой структуры. К числу наиболее пригодных методов наблюдения за процессами денатурации принадлежат спектроскопические измерения, измерения оптической активности и определение каталитической активности ферментов или биологической активности гормонов. Конформационные переходы при денатурации включают ряд процессов, которые в различной степени могут сказываться на каждом из наблюдаемых изменений, и поэтому понятие степени денатурации бессмысленно, если не будет установлен критерий, с помощью которого денатурация измеряется. Эта точка зрения иллюстрируется рис. 44, на котором изображено изменение оптической активности, поглощения света и ферментативной активности рибонуклеазы [389]. [c.136]

В случае обратимой денатурации восстанавливается исходная строго определенная макроструктура полипептидной цепи и регенерируется каталитическая активность фермента. Так, например, нарушение третичной структуры рибонуклеазы восстановлением четырех дисульфидных мостиков тиогликолевой кислотой в 8 М растворе мочевины приводит ж полной дезактивации фермента. Однако при последующем окислении сульфгидрильных групп кислородом каталитическая активность восстанавливается, т. е. регенерируется исходная макроструктура фермента. Дисульфидные связи образуются в тех же местах, что и в нативной молекуле. [c.204]

В противоположность инсулину, нри окислении которого надмуравьиной кислотой образуются два фрагмента, окисление дисульфидных связей в рибонуклеазе указывает на наличие одной пептидной цепи [4]. Было предположено, что в отсутствие сульф-гидрильных групп пептидная цепь находится в виде клубка, причем четыре дисульфидных мостика соединяют между собой восемь полуцистиновых пептидных фрагментов. При окислении метионин превращался в сульфон. Во избежание образования побочных хлорнроизводных тирозина [77] необходимо удаление ионов хлора. [c.414]

Интересные результаты были получены при изучении рибонуклеазы. Этот фермент содержит в молекуле четыре дисульфидные связи, при восстановлении которых образуются восемь тиоловых групп. При окислении восстановленного фермента в определенных условиях был получен продукт, каталитическая активность которого составляла 62% от активности исходного соединения [84]. Так как возможно 106 сочетаний, в которые могут вступать восемь тиоловых групп, образуя четыре дисульфидные [c.40]

После расщепления дисульфидных связей белок либо распадается на составляющие его цепи (подобно инсулину), либо разворачивается, образуя одну длинную цепь (подобно рибонуклеазе). Как известно, не все белки содержат цистин однако имеются и другие возможности сшивки цепей, например при помощи фосфо-эфирных связей. Кроме того, следует иметь в виду, что трехмерная структура белка, несомненно, приводит к взаимодействию боковых цепей аминокислот друг с другом или с какими-либо участками пептидной цепи. Важную роль в образовании уникальной структуры белка, обеспечивающей его биологическую функцию, играют прочно связанные с ним вещества небелковой природы, такие, как металлы, пигменты и сахара. Молекула гемоглобина человека состоит из четырех пептидных цепей (двух а- и двух -цепей), соединенных с четырьмя геминовыми группами, которые и являются переносчиками кислорода. Структуры обеих цепей гемоглобина (по Брауницеру и др. 1 ]) и миоглобина [2, 3] приведены на фиг. 50. Интересно, что, согласно недавно опубликованной структуре субъединицы белка вируса табачной мозаики [4], в цепи из 158 аминокислотных остатков отсутствуют поперечные связи (фиг. 51). [c.113]

Бесспорные экспериментальные данные о полной реставрации активной трехмерной структуры белка после его денатурации, т.е. разрушения всех элементов нативной конформации и разрыва дисульфидных связей, получены в 1961 г. К. Анфинсеном и сотрудниками при изучении рибонуклеазы А. Было доказано, что развернутая полипептидная цепь фермента с восстановленными сульфгидрильными группами остатков ys вновь самопроизвольно свертывается после удаления денатурирующего агента, принимая конформацию, неотличимую от чисто природного объекта в отношении системы дисульфидных связей и каталитической активности. Такой же результат Анфинсен и соавт. [156, 157] позднее получили при изучении обратимой денатурации 408 [c.408]

Естественно, что полной обратимости денатурации следует ожидать для белков, не содержащих групп, вступающих в денатурированном состоянии в необратимые реакции (например, окисление 5 — Н-групп) [101]). Так, доказана обратимость денатурации рибонуклеазы [135], такаамилазы А [136] и а-амилазы [136]. В работах Анфинсена и др. [137—140] показано, что можно добиться ренатурации белков и с разорванными дисульфидными связями. Из этих данных следует, что денатурацию действительно можно трактовать как термодинамический конформационный переход и что нативная структура белка отвечает если не глобальному, то относительному минимуму свободной энергии. [c.249]

Вопросами образования специфических дисульфидных связей занимались Анфинсен и др. (1961 г.), которые выбрали для работы рибонуклеазу. Белок рибонуклеаза (мол. масса около 14000) имеет четыре дисульфидные связи и не содержит свободных групп 8Н. Со- [c.271]

Однако данные, получаемые этим методом, весьма относительны, поскольку сама дифференцировка быстро и медленно обменивающихся атомов водорода часто бывает затруднительной. Причина этого состоит в следующем. Известно, что благодаря образованию отдельных вторичных связей (дисульфидные мостики, взаимодействие боковых радикалов и т. п.) могут возникать напряжения на отдельных участках а-спирали, которые приводят к ослаблению водородных связей. В результате атомы имидного водорода в этих звеньях будут обмениваться несколько быстрее, нежели атомы других пептидных групп, но медленнее, чем при полном отсутствии водородных связей. Например, из 123 пептидных водородов рибонуклеазы 70 обмениваются при 0° медленно, т. е. степень спирализации можно считать равной 57%. Но из этих 70 имидных водородов, стабилизированных Н-связями, 25 способны обмениваться с водой при 0° за несколько суток, 25 дополнительно обмениваются при 38° за сутки и лишь 20 не способны обмениваться вплоть до температуры плавления а-спирали. Отсюда степень спирализации может быть оценена и в 36% (45 медленно обменивающихся Н-атомов), и в 16% (20 необменивающихся Н-атомов). Поэтому метод скорости дейтерации может быть использован для оценки степени спирализации белка лишь в совокупности с другими приемами анализа. [c.107]

Из приведенных данных видно, что молекулы трипсина, а еще в большей мере химотрипсина, теряют способность проникать в зерно сорбента, что связано, естественно, с увеличением размеров макромолекул. У химотрипсина это происходит даже несмотря на образование трех осколков из каждой макромолекулы. Совершенно иначе ведет себя рибонуклеаза. Разрушение дйсульфид-ных мостиков и дальнейшее ацетамидирование приводят к увеличению проницаемости смолы этими макромолекулами, т. е. к уменьшению их размеров. Метод одноактной сорбции белков ионообменными смолами с целью анализа размеров макромолекул может быть сопоставлен с хроматографическим фракционированием белков методом гельфильтрации на сефадексе. Одноактная сорбция на ионитах и гельфильтрация на сефадексах приводят к идентичным суждениям об изменчивости морфологии белков после разрыва дисульфидных групп в трипсине, лизоциме и рибонук-леазе. [c.198]

Изучение последовательности аминокислотных остатков в рибонуклеазе практически началось с работ К. Анфинсена и его сотрудников, которые в 1954 г. при помощи метода динитрофенилирования установили, что ее молекула представляет собой одиночную пептидную цепь, на М-конце которой имеется следующая последовательность аминокислотных остатков лиз.глу.-тре.ала. [1]. Немного позже к изучению химической природы рибонуклеазы приступила группа исследователей Рокфеллеровского института в США, во главе которой стояли Мур, Стейн и Хирс. Группа этих ученых провела определение химического состава рибонуклеазы и установила, что составляющая ее полипептидная цепь содержит 124—126 аминокислотных остатков, которые были определены количественно [413]. Следующим этапом изучения химического строения рибонуклеазы явилось окисление ее надмуравьиной кислотой при низкой температуре, что исключало возможность модификации тирозина. При этом происходил разрыв дисульфидных связей с образованием восьми сульфоновых групп и переход четырех остатков метионина в соответствующее сульфоновое производное. После гидролиза трипсином изучали тринадцать наиболее крупных пептидов, содержавших все 124 аминокислотных остатка, входивших в состав рибонуклеазы [255]. Для выяснения порядка соединения этих пептидов друг с другом было проведено параллельное исследование пептидов пептического и химотриптического гидролизатов, что позволило построить неполную формулу окисленной рибонуклеазы, которая была дополнена сведениями о расположении амидных групп глютаминовой и аспарагиновой кислот [39]. [c.136]

Методы белкового синтеза развиты в настоящее время в такой степени, что ферменты, молекулы которых имеют небольшие размеры, могут быть синтезированы в лабораторных условиях. Это дает возможность создавать новые модифицированные ферменты и критически анализировать роль различных групп активного центра. Так, например, установлено, что построенный из 70 аминокислотных остатков синтетический пептид, аналогичный рибонуклеазе 5, но несущий ряд делеций и, совершенно не содержащий дисульфидных связей, все же сохраняет заметную каталитинескую активность [61]. [c.121]

В реакции окислительного расщепления пептидной связи тирозина N-иодосукцинимид столь же эффективен, как и N-бромо-сукцинимид. Реакцию проводят при pH 4,5, выход на модельных соединениях и простых тирозинсодержащих пептидах составляет 25—95%. Механизм реакции идентичен расщеплению с помощью N-бромосукцинимидом [100]. Показано, что пептидная связь тирозина расщепляется с умеренным выходом при электролитическом окислении на платиновом электроде. При этом в отличие от реакции с N-бромосукцинимидом не наблюдается расщепления по триптофану и гистидину однако идет окисление других функциональных групп (имидазоль-иых, тиоэфирных, дисульфидных и аминогрупп), правда с меньшей скоростью, чем фенольных групп тирозина. С помощью этого метода были специфически фрагментированы по остатку тирозина ангиотензин, инсулин и рибонуклеаза [30]. [c.118]

Наибольшее значение в белке имеют дисульфидные и гидрофобные связи. В последнее время все чаще высказываются сомнения в том, могут ли водородные связи и связи солевого типа с их относительно низкой энергией обеспечить жесткую конформацию цепей, когда белковые молекулы находятся в водных растворах. Роль водородных и солевых связей относительно невелика. В тех белках, которые содержат остатки цистина — 5—8-мостики играют, по-видимому, важную роль в образовании внутримолекулярных поперечных соединений, в частности между различными участками одной и той же пептидной цепи. Такие связи обнаружены в сывороточном и яичном альбуминах, рибонуклеазе (см. рис. 3), лизоциме, эдестине и др. Вероятно, главная причина этого — относительно высокая прочность дисульфидных мостиков. Неполярные боковые цепи в водных растворах белков окружены молекулами воды, которые могут соединяться с другими частицами воды водородными связями. Взаимное притяжение молекул воды и стремление гидрофобных групп к объединению с группами такого же типа приводит к их вытеснению из водной среды и значительно повышает их сродство друг другу. Гидрофобные связи играют важную роль в поддержании характерной конформации нативных протеинов. [c.34]

Анфинсен и Габер [21] часто применяли гель-филь-трацию на сефадексе G-25 в своих классических исследованиях по восстановлению и рекомбинации четырех дисульфидных мостиков рибонуклеазы. Сначала они отделяли восстановленный белок от мочевины, солей и меркаптоэтанола, а после замещения по SH-группам — от избытка других реагентов. Аналогично поступали при обратимом ацилировании свободных аминогрупп рибонуклеазы остатком трифторуксусной кислоты [154]. Дисульфидные мостики рибонуклеазы можно также легко расщепить тринатрийтиофосфатом при этом одновременно тиофосфорилируются образующиеся меркаптогруппы [22]. Кривые элюирования, взятые из этой работы (фиг. 24,Л), показывают, насколько быстро и эффективно меченый белок отделяется от избытка тиофосфата. Локализация остатка кислоты на атоме серы легко и надежно доказывается тем фактом, что (см., например, [155]) восстановлен- [c.144]

Подвергая нативную рибонуклеазу действию меркаптоэта-нола в присутствии мочевины, можно восстановить четыре специфические дисульфидные связи до свободных сульфгидрильных групп и разрушить вторичную и третичную структуру молекулы. Молекула восстановленной рибонуклеазы не обладает ферментативной активностью и состоит из одной полипептидной цепи, содержащей восемь остатков цистеина. Присутствие мочевины в данном случае существенно, так как дисульфидные связи не восстанавливаются, пока сохраняется вторичная и третичная структура. При окислении восстановленной рибонуклеазы с помощью кислорода в отсутствие мочевины в молекуле вновь образуются дисульфидные связи. Если бы при этом была возможна любая комбинация цистеиновых остатков, то всего существовало бы 105 вариантов расположения дисульфидных мостиков в реконструированной молекуле, т. е. вероятность образования системы связей, соответствующей нативному ферменту, была бы меньше 1%. Этот расчет является слишком упрощенным, поскольку мы не учитывали, что распределение остатков цистеина по цепи неравномерно и вероятность связывания соседних сульфгидрильных групп должна быть больше, чем для отдаленных друг от друга групп. Следовательно, некоторые из этих 105 вариантов более вероятны, но это не влияет существенно на результат. Итак, если фермент активен только в конфигурации, которая идентична нативной, и образование дисульфидных мостиков происходит хаотическим образом, то после восстановления и последующего окисления рибонуклеазы ее активность должна равняться примерно 1 % от исходной. Если же дисульфидные связи образуются некоторым специфическим образом, то после окисления активность должна быть равна 1QQВ дея- [c.278]

Сравнение скоростей исчезновения сульфгидрильных групп и изменения оптического вращения при окислении восстановленной рибонуклеазы со скоростью восстановления ферментативной активности показало, что сначала наблюдается зависящий от концентрации период индукции, в течение которого скорость восстановления ферментативной активности отстает от скорости исчезновения сульфгидрильных груг(п и уменьшения вращения. Посредством химического анализа было установлено, что- на этом этапе образуются межмолекулярные дисульфидные связи, которые затем исчезают в результате сульфгидрил-ди-сульфидных реакций обмена, приводящих к образованию термодинамически выгодной нативной структуры. О том же свидетельствуют эксперименты, показавшие, что рибонуклеаза, утра- [c.279]

Очень важный и принципиальный вопрос химии белка заключается в том, определяется ли вторичная и третичная структура белка однозначно его первичной структурой, т. е. порядком чередования аминокислот в полинентидной цепи. Ответ на этот вопрос дается опытами Анфинсена, выполненными с рибопуклеа-зой. В белке 8—8-мостики постепенно разрывались путем восстановления меркаптоэтанолом в растворе 8М мочевины. По мере разрушения дисульфидных связок происходит инактивация фермента рибонуклеазы, вплоть до полного исчезновения каталитических свойств. После окисления сульфгидрильных групп воздухом наблюдается полный возврат к исходному белку как в отношении числа мостиков, так и ферментативной активности. В этом случае сшивка 8—8-связей осуществляется обязательно в том же порядке, как в активном белке. Однако известны и противоположные примеры, особенно если белок состоит из нескольких цепей, соединенных дисульфидными сшивками. Так, например, восста- [c.85]

Опыт подтверждает это. В частности, важны, по-видимому, водородные связи, образуемые боковыми тирозиновьши ядрами с глютаминовой и асиарагиновой кислотой (см. стр. 63). Соответствующие водородные связи закрепляют третичную структуру и без дисульфидных мостиков, а последние делают ее более прочной, что доказано опытами Анфинсена по отравлению процесса регенерации восстановленной рибонуклеазы. Оказалось, что до бавление 8М мочевины, дезорганизующей вторичную структуру цепи, приводит к тому, что кислород сшивает все сульфгидриль-ные группы в полном беспорядке и белок остается навсегда денатурированным. [c.86]

Рис. 49. Восстановление активности рибонуклеазы прп ее реконструкцип путем окисления сульфгидрнльиых групп, образовавшихся ири разрыве дисульфидных мостиков.

Последовательность аминокислотных остатков отдельных участков цепи в молекуле рибонуклеазы была также расшифрована группой К- Анфинсена в Университете в Бетесде. Как уже упоминалось, эта группа ученых установила последовательность Ы-концевых аминокислот, расшифровала порядок чередования аминокислотных остатков, начиная с 32-го и кончая 49-м (сер.арг.асп-МНг.лейц.тре.лиз.асп.арг.), а также четырех последних остатков в цепи (асп.ала.сер.вал.) [73]. Одновременно К. Анфинсен [403] и Д. Спекман [414] определяли положение дисульфидных мостиков в молекуле. Результатом этих исследований было установление К- Хирсом, С. Муром и У. Стейном [255] полной формулы рибонуклеазы, которая отвечала всем экспериментальным данным. [c.137]

В непрерывной полипептидной цепи рибонуклеазы попарно связаны дисульфидными мостами остатки цистеина, обозначенные одинаковыми номерами. Очевидно, что сама по себе последовательность аминокислот в молекуле рибонуклеазы еще совершенно ничего не говорит о ее каталитическом действии на связь фосфорной кислоты с рибозой в РНК. В высшей степени интересны исследования рибонуклеазы, выполненные Анфинсеном. Если подействовать р-оксиэтилмеркаптаном на раствор рибонуклеазы в водном 50%-ном растворе мочевины (где а-спираль нарушена полностью) и таким образом разорвать все S-S-мосты, то каталитические свойства ферментов полностью исчезают. Однако если полученный белок, содержащий 8Н-группы на месте S—S-мостов и освобожденный от мочевины, окислить воздухом, то все SH-группы попарно окисляются в S—S-мосты, структура рибонуклеазы воссоздается, и вновь приобретается активность. Следовательно, S-S-мосты в данном белке (и это типично) возникают на прежних местах и, несомненно, одновременно воссоздается не только вторичная, но и третичная структура, свойственная рибонуклеазе. Если же окисление производить в растворе мочевины, где обычные водородные связи вторичной структуры нарушены, то сшивание происходит в беспорядке или в ином порядке и активного фермента не получается. Таким образом, как оказалось в этом случае, пе дисульфидные мосты, а водородные связи вторичной структуры предопределяют третичную структуру, сближающую определенные цистеиновые SH-группы и создающие возможность окисления их в цистиновые мосты S—S. Вместе с тем ясно, что за ферментативную активность ответственна совокупность первичной, вторичной и третичной структур. [c.743]

На рис. 5.16 приведена схема эксперимента, вьшолненного Анфинсеном и др. Нативную рибонуклеазу сначала денатурировали -меркаптоэтанолом (HO Hj HjSH) в 8М растворе мочевины при этом происходило восстановление дисульфидных мостиков и молекула принимала развернутую конформацию. Затем мочевину удаляли и раствор подвергали воздействию воздуха (Oj) при умеренно щелочных pH (pH 8) для того, чтобы рео-кислить полуцистины. Полученные результаты приведены на рис. 5.17, где показаны изменения различных ферментативных свойств в зависимости от времени реокисления. Кружками отмечено уменьшение числа свободных групп SH, квадратиками — изменение оптического вращения при 366 нм. Как видно из рисунка, оба типа точек ложатся на одну кривую. Это дает основание полагать, что уменьшение числа свободных групп SH идет параллельно процессу образования упорядоченной структуры, что сопровождается увеличением оптического вращения. [c.273]