Хроматография градиентное элюирование

Градиентная хроматография, градиентное элюирование. Перемещение компонентов смеси происходит при одновременном воздействии потока элюента и движущейся концентрационной волны вытеснителя. Например, к азоту при проявлении углеводородов добавляют диоксид углерода, концентрация которого непрерывно или скачкообразно возрастает во времени. Этим достигается более эффективное разделение [219—221]. [c.93]

Для достижения более полного разделения пользуются градиентной тонкослойной хроматографией (градиентное элюирование) — применение элюирующей системы с меняющейся концентрацией солей (градиент концентрации), меняющимся отношением полярных и неполярных растворителей (градиент полярности), меняющимся значением pH (градиент pH) [221,238]. [c.102]

Наибольшим достоинством жидкостной хроматографии является градиентное элюирование — изменение состава элюента во времени, позволяющее разделять смеси различной полярности за счет изменения коэффициента распределения. Градиентное элюирование можно рассматривать как аналог программирования температуры в газовой хроматографии. [c.204]

В колоночной хроматографии проводят разделение макроколичеств веществ, при этом пробу в виде раствора отмеряют обычной мерной посудой. Подвижную фазу вводят в верхний конец колонки из резервуара, используя способ нисходящей хроматографии, при которой подвижная фаза движется под действием поля земного притяжения. При небольшой скорости передвижения жидкости в колонке продолжительность анализа сокращают, повышая давление. Обычно непродолжительным считают разделение со скоростью 1—20 мм мин- или 1—10 мл-мин . При проведении градиентного элюирования или при проявлении хроматограммы (см. стр. 344) применяют простую установку, приведенную на рис. 7.9. Она состоит из двух склянок с тубусами. В сосуд А вводят чистый растворитель Ьд, в сосуд Б — растворитель Ьб- При переходе растворителя Ьд в сосуд Б с одновременным переходом подвижной фазы из сосуда Б в разделительную колонку концентрация вещества А в подвижной фазе постоянно возрастает. [c.352]

В тонкослойной хроматографии можно получать также и двумерные или круговые хроматограммы. Для градиентного элюирования применяют специальные камеры, в которых пластины помещаются на сетки. Выше сетки имеется отвод для смеси растворителей, снизу подается второй растворитель. [c.360]

Для ступенчатого градиентного элюирования хроматографических групп была использована возможность разделения смеси элюентов по способу фронтальной хроматографии [3, 5], согласно которому разделение элюентов должно идти по схеме, представленной на рис. 1. При разделении смеси, например, из трёх растворителей различной адсорбционной активности в предварительной колонке (см. рис. 1, а) первым из колонки выйдет некоторое количество наиболее слабо адсорбирующегося растворителя А в чистом виде, затем смесь растворителя А с более сильно адсорбирующимся растворителем В и, наконец, исходная смесь растворителей А, В и С. Поступая в разделительную колонку, растворитель А вытесняет с силикагеля слабо адсорбирующуюся часть образца (компонент а) и движется вместе с ним к выходу из колонки. Затем по этой же схеме десорбируются компоненты Ь и с. [c.6]

Однако наиболее часто применяют ион-парную хроматографию на обращенной фазе, при которой в качестве подвижной фазы используют водный буферный раствор и органический растворитель, смешивающийся с водой, обычно метанол или ацетонитрил. В подвижную фазу добавляют противоион, заряд которого противоположен заряду молекулы, а в качестве сорбента используют силикагель с химически привитой фазой, обычно Се или i8. Иногда разделение осуществляют с применением несмешиваемой с водой механически удерживаемой фазы, например, бутанола. При разделении на обращенной фазе более стабильной, чем механически удерживаемая фаза, водные образцы могут непосредственно вводиться в колонку, что особенно важно для анализа биологических образцов. При этом нет необходимости в предварительной очистке, так как гидрофильные компоненты мгновенно вызываются из колонки. Градиентное элюирование проводят, изменяя концентрацию противоиона в подвижной фазе или меняя полярность растворителя. При изменении концентрации противоиона, который остается в неподвижной фазе, изменяется сила растворителя, а при изменении pH подвижной фазы изменяется селективность разделения. [c.75]

Вода представляет собой важнейший растворитель в обращенно-фазной и ионообменной хроматографии. Основными примесями в воде, которые мешают проведению хроматографического процесса, являются различные соли и микропримеси углеводородов и других органических соединений. Присутствие солей недопустимо в ионообменной хроматографии, а примеси органических соединений вызывают существенные затруднения в обращенно-фазной хроматографии (особенно в градиентном элюировании) при использовании флюоресцентного и УФ-детекторов. [c.134]

Аппаратура для градиентного элюирования используется для приготовления смесей с возрастающей силой элюирования. (Градиентное элюирование в жидкостной хроматографии аналогично температурному программированию в газовой хроматографии.) Устройства для программирования состава элюента можно разделить на два основных типа [c.33]

Следует заметить, что необходимость использования подвижных фаз с довольно высокой ионной силой ограничивает применение потенциометрических детекторов в жидкостной хроматографии практически только анализом неорганических соединений и не позволяет использовать градиентное элюирование. По этой причине потенциометрическим детекторам трудно конкурировать с детекторами других типов. [c.574]

Изменение перечисленных условий хроматографии можно вести либо скачкообразно ступенчатое градиентное элюирование), либо непрерывно непрерывное градиентное элюирование). [c.556]

Определение углеводородного состава нефти и отдельных ее температурных фракций проводили методом жидкостной хроматографии на силикагеле в условиях градиентного элюирования с рефрактометрическим детектированием. Исследовали нефти из 1-го (скв. № 54 и 73), Мергельного (скв. № 20 и 51) и 2-го песчаного (скв. № 33 и 92) горизонтов. Физико-химическая характеристика образцов [c.71]

Многие дегазированные растворители способны с большой легкостью вновь поглощать газы воздуха, поэтому дегазация должна выполняться в сосуде, который используется в качестве резервуара подвижной фазы в хроматографе. Желательно дегазировать индивидуальные растворители, так как смеси при этой процедуре могут в некоторой степени изменять свой состав. С другой стороны, опыт показывает, что при смешении индивидуальных растворителей в градиентных устройствах (при градиентном элюировании либо при подготовке подвижных фаз для изократического разделения) может начаться выделение газов, даже если каждый из компонентов в отдельности был тщательно дегазирован. Это явление наблюдается обычно при работе в обращенно-фазовом режиме и объясняется, по-видимому, тем, что растворимость остаточных газов в смесях меньше, чем в индивидуальных жидкостях. В связи с этим там, где возможно, рекомендуется заполнять резервуары градиентных систем не индивидуальными растворителями, а составами, соответствующими предельным режимам предстоящей работы. Например, если предстоит разделение в градиенте от 20 до 70% метанола в воде, не следует заполнять резервуары водой и метанолом и программировать смешение от 20 до 70%. Предпочтительнее заполнить один резервуар смесью 20% метанола в воде, а второй — раствором с 70% метанола. Естественно, программировать градиент в этом случае нужно в пределах 0—100%. [c.186]

Наряду с этим направлением многого можно ожидать от более широкого использования динамического модифицирования обычных сорбентов — силикагеля или его химических производных. Выбор динамических модификаторов среди известных веществ довольно широк и по мере развития исследований в этой области может обогатиться за счет целенаправленного синтеза. Хроматографист ири минимальном наборе готовых сорбентов с помощью динамического модифицирования сможет получить широкий спектр неподвижных фаз разной селективности. Принципиальное отличие этого режима хроматографии от традиционных в том, что состав неподвижной фазы очень сильно зависит от состава подвижной. Следовательно, появляется возможность в условиях градиентного элюирования не только из- [c.352]

В некоторых случаях, в частности, в опытах, имеющих целью определение оптимального состава растворителя для метода, который затем будет использоваться повседневно, удобна методика градиентного элюирования. Состав смеси растворителей, входящих в подвижную фазу, во время хроматографирования непрерывно меняют с предварительно установленной скоростью, что дает возможность решать при помощи одной хроматограммы проблему разделения сложной смеси веществ, имеющих совершенно различные коэффициенты распределения. Коэффициент распределения К, как указано в разделе Газовая хроматография (см. ниже), является мерой количества растворенного вещества в неподвижной фазе то отношению к концентрации вещества в подвижной фазе. [c.104]

Жидкостная адсорбционная хроматография. Жидкостная адсорбционная хроматография применяется для группового разделения углеводородов на алкано-циклоалкановую и ареновую фракции, а также для разделения аренов по степени цикличности. Хроматографические колонки заполняют силикагелем или двойным адсорбентом — оксидом алюминия и силикагелем. В качестве десорбентов при анализе керосиновых и масляных фракций для вымывания насыщенных углеводородов используют н-алканы С5 — С7, для десорбции ароматических и гетероатомных компонентов — бензол, спиртобензольные смеси, ацетон, хлороформ. Применение ступенчатого или непрерывного увеличения полярности подвижной фазы позволяет значительно уменьшить время удерживания веществ. Этот метод называется градиентным элюированием. [c.130]

Хроматография. С помощью автоматического коллектора собирают фракции по 2 мл. Элюирование начинают буферным раствором pH 5,1, а после 150-й фракции начинают градиентное элюирование. В смеситель заливают 500 мл буферного раствора pH 3,1, а в резервуар — буферный раствор pH 5,1. [c.200]

Обычно хроматографию начинают при pH 7,5—8,0 и при концентрации иона С1 или СН зСОО 0,01—0,005 М и заканчивают при pH 8,0—8,5 и концентрации элюента 0,5—0,75 М. Определенные преимущества имеет градиентное элюирование. [c.203]

Г. Подбор условий хроматографии. Можно применять как ступенчатое, так и градиентное элюирование. Ступенчатое элюирование удобно только в тех случаях, когда компоненты фракционируемой смеси элюируются при существенно различающихся значениях pH и молярности элюента. [c.212]

Выбор оптимальных условий,фракционирования в каждом данном случае делается на основании предварительных опытов хроматографии. Однако, как правило, для фракционирования природных полимеров с катионными свойствами, таких, как полипептиды и белки, удобнее градиентное элюирование с увеличением молярности элюента при постоянном pH. [c.213]

Д. Хроматография на колонке с КМ-целлюлозой в Н -форме с помощью градиентного элюирования. Колонку 1,5 х 35 см заполняют КМ-целлюлозой в Н -форме и промывают дистиллированной водой, [c.213]

Подготовка системы для градиентного элюирования. В качестве смесителя используют колбу на 0,5 л со стартовым буферным раствором (0,02 М фосфатный буфер pH 8,0). Резервуар, образующий замкнутую систему со смесителем, представляет собой сосуд объемом 1 л, заполненный О,ЗМ буферным раствором. Непрерывную подачу буферного раствора на колонку осуществляют с помощью насоса. Открыв выходное отверстие, понижают уровень буферного раствора в колонке до уровня геля. Затем на ионообменник аккуратно, стараясь не взмутить верхний слой геля, наносят фракционируемую сыворотку, которую предварительно в течение суток диализуют против стартового буферного раствора. Нанесенный образец смывают тремя порциями стартового буферного раствора по 2 мл и приступают к хроматографии. Для фракционирования 3 мл сы- [c.216]

Хроматография на ДЭАЭ-сефадексе очень удобна для выделения из сыворотки IgG и для разделения белков этой фракции, обладающих разной электрофоретической подвижностью. Стартовый буферный раствор сначала вымывает из колонки IgG, имеющие низкую электрофоретическую подвижность. Быстро мигрирующие белки этого же класса выходят только при градиентном элюировании. Хроматография, на ДЭАЭ-сефадексе является также общепринятой методикой очистки миеломных IgG. [c.217]

В ионообменной хроматографии градиентное элюирование осуществляют с помощью градиента концентрации (концентрация элюирующего раствора непрерывно изменяется) или градиента pH (pH элюирующего раствора непрерывно изменяется). [c.61]

Благодаря высокой чувствительности детекторов, применяемых в современных жидкостных хроматографах, для анализа достаточно нескольких микролитров вещества. Разделение осуществляется в короткие промежутки времени за счет использования колонок малых размеров и высоких скоростей элюирования (давления на входе в колонку до нескольких сотен атмосфер). При применении некоторых типов детекторов (спектрофотометрических, транспортных и др.) можно управлять ходом разделения путем регулируемого изменения температуры, давления или состава элюента в ходе анализа. Программируемое изменение состава элюента (градиентное элюирование) плодотворно реализовано, например, в уже отмечавшейся методике ЛЭАХ [123, 124] (см. рис. 1.1). На применении транспортного детектора и смеси трех растворителей в качестве подвижной фазы основан способ [c.33]

Адсорбция из растворов олигомеров — полимеров со сравнительно небольшой молекулярной массой (от 300 до 5000) —происходит в соответствии с их химическим строением. На рис. 18.4 показано разделение олигобутадиенов и их моно- и диоксипроизвод-ных со средней молекулярной массой около 1200 на колонне с широкопористым силикагелем при градиентном элюировании с постепенным увеличением содержания полярного компонента метилэтилкетона в н-гептане. Первым из такой колонны при элюировании чистым н-гептаном выходит олигобутадиен, вторым при добавлении в н-гексан 5% метилэтилкетона выходит монооксиолигобутадиен и третьим, при содержании в н-гептане 15% метилэтилкетона, — диоксиолигобутадиен. Этот пример показывает, что методом адсорбционной хроматографии можно разделять синтетические олигомеры по типу и числу функциональных групп в их макромолекулах. [c.337]

При осуществлении элюентной хроматографии в верхнюю часть хроматографической колонки, наполненной, например, катионитом в водородной форме (Н-ф9рме), вводится смесь разделяемых ионов. Для получения компонентов в чистом виде элюирование проводят раствором кислоты или другим элюентом при постепенно возрастающей его концентрации (градиентное элюирование). Если исследуют смесь элементов разных групп периодической системы, то разделение при помощи элюирования растворами электролитов облегчается тем, что элементы разной валентности обладают различным сродством к иониту. Сорбируемость ионов возрастает от одновалентных к двух- и трехвалентным. Приблизительную закономерность сорбируемости ионов с одинаковой валентностью MOHiHO представить в виде сорбционных рядов [c.285]

В хроматографе предусмотрено использование колонок двух типов стеклянных с внутренним диаметром 1—1,5 мм, рассчитанных на работу при давлении до 1,5 МПа и создание полностью инертной хроматографической системы, и из нержавеющей стали длиной 60 и 120 мм с внутренним диаметром 2 мм. Все соединительные линии в хроматографе выполнены из толстостенных фторопластовых капилляров, на конце имеющих развальцовку, по которой и производится уплотнение при низком давлении используются капилляры из полиэтилена. Шприцевой насос Милихром имеет привод от шагового двигателя, что позволяет не только обеспечить высокую воспроизводимость времени удерживания и количества вводимой пробы, но и формировать при необходимости в камере насоса градиент растворителя заданной формы и осуществлять градиентное элюирование сложных по составу смесей веществ. Предусмотрена также работа Милихрома с микроколлектоРОМ фракций, обеспечивающим сбор микрофракций для последующей идентификации другими физико-химическими методами. [c.64]

При разработке метода разделения сложных смесей веществ, особенно биологического и природного происхождения. Исследователю часто приходится сталкиваться с тем, что в их состав не только входит большое количество соединений, но и сильно различаются их свойства. Подобрать в этом случае сорбент и растворитель, которые обеспечивали бы разделение всех или большинства интересующих исследователя компонентов, обычно не удается. Однако еще тогда, когда колонки в хроматографии были малоэффективными, было найдено и средство для решения таких задач — использование растворителя, элюирующая сила которого постепенно увеличивалась. Это приводило к тому, что как слабо, так и сильно удерживаемые вещества выходили из колонки за приемлемо короткое время, при этом зоны сильно удерживаемых соединений сужались и давали более узкие и симметричные пики. Когда эффективность колонок была повышена, популярность градиентного элюирования несколько уменьшилась, однако для многих объектов до настоящего времени это единственно приемлемый вариант — ВЭЖХ с градиентом растворителя, или градиентная ВЭЖХ (ГВЭЖХ). [c.65]

Выбор сорбента и колонки для ГВЭЖХ также имеет свои особенности. Прежде всего, колонка должна быстро приходить в равновесие с растворителем постоянно изменяющегося состава как в процессе градиентного элюирования, так и при возвращении к исходному составу растворителя при подготовке колонки к новому анализу. Если для старых колонок в жидкостной хроматографии, работавших однократно, градиент формировался и использовался один раз, после чего сорбент в колонке заменялся свежим, и это позволяло применять силикагель и оксид алюминия, то для ГВЭЖХ эти сорбенты не подходят, так как уравновешивание их со слабым растворителем после градиента слишком длительно. Однако современные обращенно-фазные и другие привитые сорбенты достаточно быстро приходят в равновесие с исходным растворителем после окончания градиентного элюирования, что позволяет успешно использовать их для этих целей. Время, необходимое для уравновешивания колонки, для каждого сорбента устанавливается экспериментально по достижению постоянства времени удерживания веществ, входящих в анализируемую смесь. Это время различно как для разных сорбентов, так и для разных по составу растворителей, и может колебаться от десятков до нескольких сотен минут. [c.66]

Большой интерес для эксклюзионной хроматографии представляют гели сферой. Эти макропористые сорбенты с высокой плотностью сшивки получают сополимеризацией оксиэтилметакрилата с этилендиметакрилатом. Они набухают как в воде, так и во многих органических растворителях, в частности, в тетрагидрофуране. Степень набухания гелей в разных растворителях почти одинакова и не меняется в широком интервале эачений pH и ионной силы, что позволяет рассматривать их как универсальные сорбенты для эксклюзионной хроматографии в органических растворителях и водных системах. Иногда можно заменять водный растворитель на органический в провесе разделения, т. е. работать в режиме градиентного элюирования. [c.105]

Высокая стабильность скорости потока. Точность поддержания скорости потока в колонке во многом определяет результаты как качественного, так и количественного анализа. Для основных вариантов ВЭЖХ нестабильность потока не должна превышать 0,5—1%. В эксклюзионной хроматографии при анализе молекулярно-массового распределения полимеров требования еще выше—0,1—0,3%. Кроме того, весьма желательно, чтобы насос не давал пульсации потока и имел малый рабочий объем для быстрой смены растворителя в режиме градиентного, элюирования. [c.139]

Основной недостаток насосов постоянного давления — изменение расхода подвижной фазы при изменении сопротивления системы. Сопротивление колонки может повыситься из-за загрязнения входного фильтра, насадки или предколоночного фильтра. Оно меняется с изменением вязкости растворителя, происходящим при колебаниях температуры и практически всегда наблюдающимся при градиентном элюировании. Поэтому насосы данного типа постепенно вытесняются насосами постоянного расхода и применяются, главным образом, в препаративной хроматографии и для набивки колонок. [c.139]

Компьютерные системы обработки данных являются наиболее сложными и дорогими. Они делятся на две группы. Устройства первой группы предназначены только для обработки данных и представляют собой малогабаритные вычислительные машины с большим объемом памяти, которые выполняют разнообразные сложные расчеты (например, в эксклюзионной хроматографии) и представляют результаты в цифровой и графической форме. Устройства, относящиеся ко второй группе, кроме обработки данных, осуществляют управление различными элементами хроматографической системы. К тагим элементам относят, в частности, установку параметров процесса (температура, скорость потока, условия детектирования и др.) и состав подвижной фазы в изократическом и градиентном элюировании, режим работы автоматического дозатора и т.п. Все необходимые параметры постоянно контролируются, что гарантирует их стабильность в процессе разделения. [c.160]

В некоторых случаях целесообразно проводить градиентное элюирование, при котором содержание более полярного растворителя в менее полярном повышают непрерывно. Градиентное элюирование проще всего осуществить, возвращая отогнанный от каждой фракции растворитель на колонку с добавлением к нему каждый раз одного и того же объема второго, более полярного растворителя. Если ход хроматографического разделения известен заранее, то можно использовать автоматическое гpaJ диентное элюирование, описанное в главе, посвященной ионообменной хроматографии. [c.364]

В области разделения малых молекул с помощью аналитической ЖХ градиентное элюирование стало ценным средством при исследовании сложных смесей или групп соединений с неизмеримой хроматографической полярностью. Успехи приборостроения, в частности создание систем подачи растворителя и систем смешения, совершенствование конструкции детекторов, а также контроль работы приборов на основе микропроцессоров сделали возможным высокий уровень воспроизводимости в схемах разделения с непрерывным градиентом. Микропрепаративное ЖХ-разделение, выполняемое на аналитическом оборудовании, может реализовать эти возможности. Однако при переходе в область препаративной и макропрепаративной хроматографии значительно уменьшаются возможности создания сложных градиентов и контрольных устройств, пригодных для работы с большими объемами и высокими скоростями подвижной фазы, которые бы воспроизводили точно градиенты, характерные при работе с аналитическими приборами. В таких ситуациях обычно рекомендуют использовать подходящую последовательность изокра-тического и ступенчатого градиентного элюирования, если оно вообще возможно (см. разд. 1.6.2.2.5). Выгоды такого подхода [c.67]

НОГО таким об])азом. Конкретное обозначение может быть или не быть основано на характеристиках, важных в препаративпой ЖХ. Например, квалификация для пестицидов обычно рклю-чает проверку на наличие соединений, влияющих на отклик электронозахватного детектора в газохроматографическом анализе, что не важно в препаративной ЖХ. Квалификация для ЖХ имеет различные значения в случае различных растворителей. Для водорастворимых растворителей, используемых в обращенно-фазной ЖХ, проверяется уровень поглощения в УФ-области или наличие флуоресцирующих загрязнений, которые дают фоновый щум или становятся видны при градиентном элюировании. В случае других органических растворителей более важными факторами, определяющими их маркировку для жидкостной хроматографии, могут быть тип, наличие или отсутствие конкретных стабилизаторов, содержание воды, показатель преломления, особые загрязнения и т.д. [c.95]

У большей части белков в процессе хроматографии сразу происходит изменение величины К[От О до 1.Это вызвано тем, что белки либо прочно сорбируются на ионообменнике, либо выходят с элюирующим буферным раствором, поскольку происходит одновременная взаимная нейтрализация многочисленных реакций взаимодействия между белком и ионообменником при данных pH и ионной силе раствора. Поэтому важно тщательно подбирать буферный раствор для ионообменной хроматографии белка. Ионообменную колонку обычно загружают при низкой ионной силе раствора. Для катионообменника оптимальная величина pH равна 4—5, для анио-нообменника 7—8- Элюирование с колонки катионообменника происходит при увеличении pH буферного раствора, а с колонки анионо-обменника — при уменьшении pH. В том и другом случае с изменением pH можно увеличивать ионную силу. Изменение pH и ионной силы элюирующего буферного раствора можно производить поэтапно (ступенчатое элюирование) или непрерывно (градиентное элюирование). [c.22]

Как и в предыдущих разделах, мы попытаемся кратко рассмотреть применение ионообменной хроматографии на примере изучения белков сыворотки. До сих пор наиболее популярным методом разделения сывороточных белков является хроматография на колонке анионообменной ДЭАЭ-целлюлозы по методу Собера и Петерсона [18]. Предложено несколько модификаций этого метода. Фракции сыворотки элюируются с колонки различными способами градиентного элюирования и выходят обычно в следующем порядке IgG (как правило, имеет несколько пиков), р-, а-глобулины и затем альбумин. Этот метод особенно эффективен для приготовления препаратов IgQ высокой иммунохимической чистоты из нативной сыворотки. Его можно комбинировать с другими способами очистки, например с осаждением риванолом, Na2S04 и т. п. Подобным образом в качестве одного из этапов препаративного выделения анионообменная хроматография может применяться для очистки других белков сыворотки. При изучении структуры белка ее можно использовать для выделения и очистки полипептидов после расщепления белка ферментами или какими-либо другими веществами. [c.23]

Хроматография. Пептиды фракционируют с помощью градиентного элюирования. Стартовый буферный раствор имеет pH 3,Ь Смеситель содержит 2500 мл 0,5 н. буферного раствора pH 5,1. Элюат, вытекающий из колонки, собирают фракциями по 10 мл-Нингидриновую реакцию ставят либо непосредственно с полученным элюатом, либо после его щелочного гидролиза. [c.198]

Фиг. 41. Градиентное элюирование при ионообменной хроматографии. Буферный раствор, заполняющий резервуар А, имеет ббльшую ионную силу, чем раствор, находящийся в смесителе Б. Градиенты концентрации / — линейный 2 — вогнутый

Справочник химика 21

Химия и химическая технология