Элюирование ионная сила

Элюирование разделяемых веществ с колонок, как правило, проводят растворами, изменяя pH, ионную силу (концентрацию) или оба показателя одновременно. При этом градиент pH и ионной силы может быть ступенчатым или непрерывным (плавным). При создании ступенчатого градиента пользуются серией буферных растворов, пропускаемых через колонку последовательно один за другим. При этом виде элюции каждый из элюирующих буферных растворов пропускают че- [c.104]

Элюирование белков с колонки и исследование фракций. При работе с колонками, заполненными гидроксилапатитом, рекомендуют ступенчатое повышение ионной силы. [c.115]

Следует заметить, что необходимость использования подвижных фаз с довольно высокой ионной силой ограничивает применение потенциометрических детекторов в жидкостной хроматографии практически только анализом неорганических соединений и не позволяет использовать градиентное элюирование. По этой причине потенциометрическим детекторам трудно конкурировать с детекторами других типов. [c.574]

Изменение концентрации в зависимости от объема может быть либо линейным, либо нелинейным (рис. 501, б). В большинстве случаев выгодно, чтобы pH или ионная сила буфера при элюировании непрерывно возрастали. [c.559]

В то время как амины и аминокислоты, несущие положительный заряд, более прочно удерживаются при более высоких значениях pH, для отрицательно заряженных сорбатов справедливо обратное. Систематические исследования, проведенные на серии N-бензоил-о, L-аминокислот, позволили глубже понять механизм взаимодействия сорбата с белком. Влияние изменения свойств подвижной фазы на величины к VI а демонстрирует рис. 7.10. Во-первых, удерживание в значительной степени возрастает с усилением гидрофобного характера аминокислоты (Ser > А1а> Phe). Во-вторых, увеличение суммарного отрицательного заряда белка с увеличением pH вызывает уменьшение к для всех шести соединений (вследствие ионного взаимодействия). Далее, влияние концентрации буфера можно объяснить усилением адсорбции вследствие ионных взаимодействий при низкой ионной силе. Небольшое, но вполне заметное возрастание к для наиболее сильно удерживаемых сорбатов при высоких концентрациях буфера вероятнее всего является результатом усиления гидрофобных взаимодействий. Поскольку ионные (кулоновские) и гидрофобные взаимодействия по-разному подвержены влиянию ионной силы, то оба эффекта приводят к возникновению минимума в адсорбции сорбата (к ) в определенной точке. И наконец, совершенно очевидно влияние органического растворителя-модификатора он всегда приводит к понижению удерживания сорбата и тем сильнее, чем более гидрофобен сорбат. Влияние pH и ионной силы на удерживание незаряженных соединений невелико, но выражено вполне отчетливо. Оно связано исключительно с изменениями в связывающем центре ХНФ. Добавление пропанола-1 вызывает уменьшение удерживания по сравнению с наблюдаемым у заряженных сорбатов, что свидетельствует о преимущественном вкладе в удерживание гидрофобных взаимодействий. Это подтверждает также наблюдаемое очень большое влияние на удерживание длины цепи алканола-1. Высшие спирты являются значительно более эффективными конкурентами за связывающий центр, а потому вызывают более быстрое элюирование сорбата. Возможность регулирования удерживания путем изменения подвижной фазы, которую демонстрирует схема 7.6, говорит о том, что эту особенность данных хроматографических систем можно использовать в целях оптимизации разделения. [c.135]

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

НС1 буферах, содержащих 6—8М раствор мочевины. Элюирование пептидов осуществляется прн постепенном повышении ионной силы раствора. [c.54]

На этой диаграмме А, В и С — три различных элюента. Их можно смешивать в любой пропорции, получая смесь, элюирующая способность которой меняется в результате изменения концентрации, ионной силы, pH, полярности и т. д. Это основной принцип градиентного элюирования. В смесительном узле осуществляется контроль за концентрацией (или другими перечисленными выше характеристиками) подвижной жидкой фазы, поступающей в колонку. Регулятор давления обеспечивает создание высокого давления на входе в колонку или снижение давления на выходе из нее. Благодаря контролю за температурой работа колонки ведется в изотермическом режиме или в режиме запрограммированного изменения температуры, предусматривающего изменение температуры колонки во времени или создание различного типа температурных градиентов вдоль колонки. [c.61]

Однако бумага как носитель не лишена некоторых недостатков. Она имеет низкую емкость по отношению к экстрагентам, что вынуждает работать с. очень небольшими количествами элементов и осложняет последующее детектирование элементов. Скорость элюирования меняется в зависимости от количества нанесенного экстрагента или ионной силы элюента она также меняется по мере движения фронта элюента. Величина скорости элюирования имеет большое значение, так как часто кинетические эффекты влияют на механизм удерживания. Кроме того, вдоль хроматограммы может меняться отношение объемов фаз, а также концентрация компонентов в элюирующем растворе. Несмотря на это, в большинстве случаев результаты, полученные на бумаге, сравнимы с результатами, полученными методами, которые свободны от этих недостатков. Это справедливо не только по отношению к зависимости м =lg(l/iг/—1)] от разных параметров, но и по отношению к факторам разделения, полученным для двух заданных элементов. [c.463]

Слабоосновные пептиды фракционируют в буферных растворах с pH 6,5—7,0, т. е. в той области, где аминогруппа заряжена частично. В этой области pH амберлит ШС-50 обладает высокой буферной емкостью, что препятствует элюированию со сменой pH. Поэтому фракционирование проводят в градиенте ионной силы, но при постоянном значении pH. Постоянства pH достигают применением фосфатных буферных растворов градиент ионной силы задают путем повышения концентрации фосфата или хлорида натрия. Разделение пептидов происходит в данном случае благодаря сочетанию двух факторов ионного [c.408]

В случае колоночной хроматографии ионообменники работают в условиях, далеких от насыщения. Например, при сорбции белков емкость ионита составляет не более 5—10% от его полной емкости. Образец следует вносить в колонку в небольшом объеме только в том случае, если все операции (приведение в равновесие колонки и элюента, растворение образца и элюирование) проводят в одном, рабочем буферном растворе. Если элюирование будут вести в градиенте pH или ионной силы, образец можно вносить в большом объеме разбавленного раствора. [c.434]

Элюирование в градиенте является удобным методом поиска оптимальных условий разделения сложной смеси. В этих условиях белки либо сорбированы на ионите, либо вообще не удерживаются матрицей, т. е. Rf может принимать значения либо О, либо 1 [19]. Поиску оптимальных условий элюирования может способствовать тот факт, что белки, сорбированные на карбоксилсодержащих ионообменниках, элюируются при ионной силе примерно 0,1 буферным раствором, значение pH которого отличается от изоэлектрической точки белка на 0,4—0,6 [20]. [c.436]

ДНК можно иммобилизовать на целлюлозе и использовать в качестве сорбента для выделения комплементарных ей нитей ДНК и РНК [116]. Адсорбцию в этом случае проводят в условиях, способствующих ренатурации ДНК. Элюирование ведут в убывающем градиенте ионной силы и при повышении температуры колонки. [c.80]

Как указывалось в гл. 2 (рис. 2.1), специфически сорбированный выделяемый фермент может быть освобожден из комплекса с пришитым аффинным лигандом либо при помощи раствора конкурентного ингибитора (биоспецифическое элюирование), либо при изменении среды. Последний метод является более общим как правило, меняют pH или ионную силу раствора. Хотя влияния таких изменений могут иметь сложный характер, Грейвс и Ву [3], выводя закономерности для освобождения фермента с аффинного [c.26]

Применение для элюирования специфически сорбированных вешеств градиента pH и градиента концентрации соли и влияние ионной силы и неспецифической сорбции рассмотрены далее в гл. 10. [c.91]

Иногда перед адсорбцией на специфическом сорбенте бывает необходимо освободиться от белков-примесей путем предварительного фракционирования. Если изменить условия адсорбции, такие, как pH, ионную силу, темшературу, скорость потока и диэлектрическую проницаемость, можно избирательно исключить некоторые ферменты. Более того, для предотвращения адсорбции некоторых из них можно добавить в раствор ингибитор или другие лиганды. Используя носитель с порами малого размера, можно исключить белки с высокой молекулярной массой. Повысить избирательность можно также, применяя специфическое элюирование. Специфические ингибиторы или субстраты могут быть применены для избирательного элюирования индивидуальных ферментов. В гл. 10 приведены примеры разделения смесей ферментов на сорбентах с групповой специфичностью для выделения индивидуальных веществ применялись градиенты pH, ионной силы или температуры. [c.107]

После заполнения колонки ионитом, обработки буферным раствором и BBo.jM пробы приступают к элюированию — пропусканию элюента через колонку. Элюирование может быть простое, когда используют один элюент, такой же, как взятый для растворения пробы, и ступенчатое, при котором элюирование ведут более сильными элюентами, чем растворитель, использованный для растворения пробы. Если хроматографическая колонка заполнена катионитом в Н + -форме, то концентрация ионов Н + в элюенте должна быть более высокой. Для колонок, заполненных анионитом в ОН -форме, концентрация ОН -ионов в элюенте должна возрастать. Если применяется ионит в солевой форме, то используют элюенты с возрастающей концентрацией других противоионов, чтобы обеспечить условия десорбции. Для создания необходимой ионной силы в элюент добавляют нейтральные электролиты (K I, Na l). [c.360]

Большой интерес для эксклюзионной хроматографии представляют гели сферой. Эти макропористые сорбенты с высокой плотностью сшивки получают сополимеризацией оксиэтилметакрилата с этилендиметакрилатом. Они набухают как в воде, так и во многих органических растворителях, в частности, в тетрагидрофуране. Степень набухания гелей в разных растворителях почти одинакова и не меняется в широком интервале эачений pH и ионной силы, что позволяет рассматривать их как универсальные сорбенты для эксклюзионной хроматографии в органических растворителях и водных системах. Иногда можно заменять водный растворитель на органический в провесе разделения, т. е. работать в режиме градиентного элюирования. [c.105]

Для селективного элюирования поглощенных ионов можно использовать воду, буферный раствор (фосфатный, ацетатный, боратный, гидрокарбонатный и др.) с определенным значением pH и ионной силы, растворы минеральных (соляная, азотная, серная, фосфорная) и органических (фенол, лимонная, молочная, винная, щавелевая, ЭДТА) кислот. Выбор элюента облегчается тем, что предельные коэффициенты распределения большинства [c.317]

У большей части белков в процессе хроматографии сразу происходит изменение величины К[От О до 1.Это вызвано тем, что белки либо прочно сорбируются на ионообменнике, либо выходят с элюирующим буферным раствором, поскольку происходит одновременная взаимная нейтрализация многочисленных реакций взаимодействия между белком и ионообменником при данных pH и ионной силе раствора. Поэтому важно тщательно подбирать буферный раствор для ионообменной хроматографии белка. Ионообменную колонку обычно загружают при низкой ионной силе раствора. Для катионообменника оптимальная величина pH равна 4—5, для анио-нообменника 7—8- Элюирование с колонки катионообменника происходит при увеличении pH буферного раствора, а с колонки анионо-обменника — при уменьшении pH. В том и другом случае с изменением pH можно увеличивать ионную силу. Изменение pH и ионной силы элюирующего буферного раствора можно производить поэтапно (ступенчатое элюирование) или непрерывно (градиентное элюирование). [c.22]

Фиг. 41. Градиентное элюирование при ионообменной хроматографии. Буферный раствор, заполняющий резервуар А, имеет ббльшую ионную силу, чем раствор, находящийся в смесителе Б. Градиенты концентрации / — линейный 2 — вогнутый

Элюирование из колонки в аффинной хроматографии может вызываться каким-либо растворимым аффиантом, образующим более прочное соединение с выделяемым веществом, чем привитые аффинные лиганды, изменением ионной силы раствора или температуры. В наиболее общем случае элюирование достигается путем изменения pH раствора, приводящего к подавлению диссоциации функциональных групп, ответственных за образование химической связи между сорбатом и сорбентом. Учитывая селективность сорбции, разделение в аффинной хроматографии часто реализуется по простейшей схеме динамической сорбции 1юглощение целевого биологически активного вещества на колонке с удалением в фильтрат несорбируе-мых примесей и его последующее элюирование в виде единственного хроматографического пика. Подобная схема оказывается наиболее удобной при решении препаративных задач. [c.201]

Разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают определ. время или пропускают с определ. скоростью через колонку, наполненную сорбентом, до полного связывания исследуемого компонента. Затем сорбент многократно промывают буферным р-ром для удаления несвязав-шихся в-в, после чего элюируют исследуемый компонент козой порцией буферного р-ра, содержащего лиганд, вытес-к. пощий связанный компонент. Элюирование можно проводить буферным р-ром с более высокой ионной силой или др. значением pH, если эти факторы оказывают существ, влияние на прочность связывания компонента с сорбентом. Эффективность разделения зависит от сродства между биологически активным в-вом и лигандом, стерпч. доступности к конц. лиганда на носителе. [c.60]

Как отмечалось в предыдущем разделе, ионы различаются по их сродству к ионитам эта разница во многих случаях позволяет использовать ионный обмен для разделения ионов. Так, сорбция группы ионов смолой и последующее элюирование позволяют разделять ионы различного заряда. Порядок вымывания ионов одного заряда может определяться размером ионов. Использование элюанта с постоянно увеличивающейся ионной силой позволяет получать более острые пики элюируемых компонентов. [c.488]

Полученная слизь представляла собой раствор слизистого вещества в морской воде. Присутствие электролитов воды (особенно углекислых солей), обладающих способностью вступать в реакцию с кислотами и щелочами, затрудняет проведение достаточно точных титрований белков слизи. Поэтому слизь освобождали от солей морской воды путем гель-фильтрации через сефадекс Г-25 [91. При этом элюирование слизистого вещества проводили 0,1-мол. раствором хлористого натрия, присутствие которого создавало при титровании оптимальную ионную силу раствора. В связи с тем, что вследствие элюирования концентрация растворов слизистого вещества была ниже допустимой для потенциометрического титрования, элюаты [c.69]

Еллинек и др. в качестве сорбента для разделения ДНФ-аминокислот использовали смесь найлона-6,6 с целитом [11]. Сорбент готовят, смешивая 2 об. водной суспензии найлона-6,6 с 1 об. суспензии целита 545. ДНФ-аминокислоты фракционируют в аммонийноацетатном буферном растворе (pH 4—10) с ионной силой 0,2 иногда с добавлением этанола. Скорость элюирования 1 мл за 8 мин при 22 °С анализ элюата проводят путем определения оптической плотности. [c.365]

Идеальная матрица должна работать только по принципу молекулярного сита. Сшитые декстраны и полиакриламидные гели нельзя считать идеальными матрицами, и это необходимо учитывать при проведении эксперимента. Во-первых, эти материалы сильно сорбируют пептиды, содержащие остатки ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и фенилаланина). При элюировании буферными растворами, содержащими вещества ароматической природы, мочевину или роданид калия, адсорбция несколько снижается, однако полностью не исчезает. Известно также, что адсорбция на сефадексе несколько возрастает при увеличении ионной силы [19], однако удовлетворительного объяснения этому явлению не дано. Во-вторых, матрица содержит небольшое количество карбоксильных групп. Вследствие этого независимо от молекулярного веса пептидов может наблюдаться ускорение компонентов, несущих отрицательный заряд, и удерживание или необратимая адсорбция основных пептидов. Этот эффект подавляется в том случае, если ионная сила буферного раствора превышает 0,02. [c.396]

При фракционировании белков обычно применяют иониты, содержащие карбоксиметильную и диэтиламиноэтильную функциональные группировки, однако эти иониты не вполне подходят для разделения пептидов. Как правило, почти все кислотные пептиды адсорбируются на катионите при pH 3,0—3,5 в буфер ном растворе с низкой ионной силой, откуда могут быть элюи рованы при рн 6—9 и при более высокой ионной силе. Карбо ксилсодержащие иониты слабо диссоциированы при pH 3, и следовательно, обладают пониженной емкостью. Кроме того в разбавленных электролитах, т. е. в условиях проведения сорб ции, слишком велика буферная емкость ионита. Скачкообразное изменение pH элюента приводит на практике к одновременному элюированию группы пептидов. Аналогичные недостатки свойственны ионитам с ВЕАЕ-группой, особенно при работе с летучими буферными растворами. Изменение ионной силы и значения pH во время элюирования вызывает сжатие столбика сорбента, нарушение скорости потока и искажение профиля элюирования. В наибольшей степени этот эффект выражен у ионитов на основе слабосшитых гелей, однако в какой-то степени это свойство характерно и для модифицированных целлюлоз. И тем не менее некоторые типы ионитов на основе целлюлозы находят применение для разделения небольших пептидов. К ним относятся фосфоцеллюлоза, ЗЕ-целлюлоза, 8Р-целлюлоза и РАЕ-сефадекс. [c.411]

При разделении оснований, нуклеозидов и нуклеотидов используют различия в константах диссоциации рКа, табл. 37.5), коэффициентах распределения, в форме и размерах молекул. В качестве сорбента обычно используют синтетические иониты [32, 33] в сочетании с градиентным элюированием [34, 35]. При анализе последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах олигонуклеотиды—-продукты ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот — разделяют на ионитах на основе целлюлозы или геля декстрана [36, 37] в градиенте pH и ионной силы в присутствии мочевины [38]. [c.40]

При рн 9,0 и низкой ионной силе А и Э слабо удерживаются носителем. По мере увеличения концентрации соли прочность связывания, а следовательно, и объем удерживания возрастают. При элюировании в триссодержащем буфере на фоне Na l наб- [c.224]

Агарозные гели с привитыми углеводородными радикалами (алкил- и фе-пил-агарозы) предложены недавно для хроматографического разделения и очистки белков на основе неспецифического взаимодействия с гидрофобной поверхностью ( гидрофобная хроматография — см. Йон, 1972 и Хофсти, 1973). Фенил-агароза наряду с гидрофобным взаимодействием проявляет специфичность к ароматическим веществам (наприМер к белкам с фениловыми и тирозиловыми группами) иа основе я-л взаимодействия ароматических остатков. Элюирование веществ при гидрофобной хроматографии достигается изменением ионного состава раствора, понижением его ионной силы или полярности (например посредством включения этиленгликоля в состав элюента) или с помощью детергентов. [c.209]

М хлорид магния (pH 7,5). Около 90% фермента, пропущенного через колонку, не задерживаются и только 10% остаются связанными в колонке посредством электростатических связей и могут быть элюированы растворами с высокой ионной силой, например 1 М хлористым натрием. На основании этих результатов можно сделать вывод, что в данных условиях аминная часть лиганда мало участвует в связывании фермента. При хроматографии р-галактозидазы в аналогичных условиях (единственное отличие состояло в том, что к 0,05 М трис-НС1-буферу не добавлялись соли) почти весь нанесенный фермент был неспецифически связан в колонке 85% фермента десорбировалось при увеличении ионной силы буферного раствора добавлением 1 М хлористого натрия. Очень хорошие результаты получались, если связывание р-галак-тозидазы на замещенном геле проводилось при высокой ионной силе (1,8 М фосфатный буферный раствор), а последующее элюирование при помощи растворов с понижающимся линейным градиентом ионной силы. [c.96]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология