Кинетические методы ферментативные

Кинетическое описание ферментативных реакций в нестационарном режиме связано с определенными математическими трудностями. Например, для анализа реакции, протекающей по схеме Михаэлиса — Ментен (схема 5.1), необходимо решить систему дифференциальных и алгебраических уравнений (5.2)—(5.5). Формально-кинетический анализ ферментативных реакций развивается как по пути использования численных методов интегрирования систем дифференциальных уравнений, так и по пути использования аналитических методов. Аналитическое решение имеет определенные преимущества. Поэтому важно указать, что аналитическое решение системы дифференциальных и алгебраических уравнений может быть существенно упрощено, если при использовании определенных условий систему можно трансформировать в линейную систему уравнений. Развитие методов нестационарной кинетики ферментативных реакций идет именно по этому пути. [c.175]

Во второй части книги, посвященной ферментам, рассматриваются как традиционные вопросы биокинетики (уравнение Миха-элиса — Ментен, различные виды ингибирования, влияние pH на скорость ферментативных реакций и т, д.), так и новые, не нашедшие пока отражения в учебной литературе (новые методы нахождения элементарных констант из данных стационарной кинетики, влияние диффузии на кинетику действия иммобилизованных ферментов, использование интегральных форм кинетических уравнений, кинетический анализ систем со взаимным истощением, анализ нетривиальных типов ингибирования, применение теории графов в ферментативной кинетике и др.). Требования систематизации курса способствовали созданию новых методов обработки кинетических данных ферментативных реакций, описываемых в главах 5—8, 10, 11. [c.4]

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА, основаны на использовании хим. р-ций с участием ферментов. О содержании определяемого компонента судят либо по кол-ву конечного продукта ферментативной р-ции, либо, чаще, по начальной скорости процесса, положенного в основу методики определения (см. Кинетические методы анализа). Для наблюдения за скоростью ферментативной р-ции применяют обычно инструментальные методы, чаще других - люминесцентные, спектрофотометрич., электрохимические. Достоинства Ф. м. а. высокая чувствительность, обусловленная активностью ферментов, природой индикаторных р-ций (с помощью к-рых определяют в-во) и способами детекции аналит. сигна- [c.78]

Кинетический метод двухкомпонентного обратимого ингибирования ферментативных реакций [c.227]

В связи с этим возникает необходимость исследования механизма ферментативных реакций при помощи комплекса различных методов, которые общеприняты при изучении механизма сложных химических реакций. Среди этих методов особое место занимает кинетический метод. [c.7]

Преимущества этого метода перед другими состоят в следующем при его применении сохраняется постоянное значение pH и, следовательно, нет опасности изменения активности фермента вследствие изменений его ионизации метод сразу дает постоянную по большому числу точек кинетическую кривую, позволяющую рассчитывать необходимые кинетические константы ферментативной реакции метод позволяет измерять кинетику процесса практически при любых условиях расход времени на измерение скорости реакции весьма невелик при условиях нулевого порядка реакции обычно бывает достаточно проводить титрование в течение 3— 4 мин., зафиксировав 8—10 точек расхода щелочи метод может быть использован для исследования кинетики взаимодействия холинэстераз с ингибиторами. [c.149]

Мы надеемся, что книга окажется полезной особенно сейчас, когда значение кинетических методов исследования чрезвычайно возросло. Проработать систематически весь этот курс смогут в основном только те студенты, аспиранты и исследователи, которые специализируются в области химической или биологической кинетики, однако можно надеяться, что книга, снабженная подробным предметным указателем, в любом случае будет удобным справочником по методам обработки кинетических данных химических и ферментативных реакций. [c.4]

Вследствие громоздкости расчетного аппарата данный метод представляет лишь теоретический интерес и, не имея преимуществ по сравнению с классическими методами определения кинетических параметров ферментативной реакции, не может быть рекомендован в качестве альтернативного для обработки реальных систем. [c.110]

Предложить метод определения кинетических параметров ферментативных реакций, основанный на определении площади под кинетической кривой в координатах ([S], i). [c.175]

Предложить аналитический метод определения константы Михаэлиса, исходя из уравнения касательной к кинетической кривой в начальный момент времени и интегральной формы уравнения кинетической кривой ферментативной реакции. [c.175]

Экспериментально кинетику ферментативной р-ции в предстационарном режиме исследуют с помощью метода остановленной струи (см. Струевые кинетические методы), позволяющего смешивать компоненты р-ции в течение 1 мс. [c.82]

Кинетические методы можно испольэовать для определения субстрата в ферментативной реакции. [c.351]

Кинетические методы анализа находят все большее применение в различных областях, особенно в анализе клинических проб с помощью ферментативных реакций. Эти методы основаны на принципе, что, если определяемые частицы могут реагировать с каким-либо другим веществом, то начальная скорость реакции приблизительно пропорциональна исходной концентрации определяемых частиц. Таким образом, измерение начальной скорости реакции позволяет определять исходные концентрации реагирующего вещества. Этот метод анализа можно проводить очень быстро, поскольку нет необходимости ждать, пока реагирующие вещества достигнут состояния равновесия. Это особенно важно для медленно протекающих реакций. [c.666]

Оценка факторных эффектов. Обзорные планы используют главным образом для оценки влияния различных факторов статистическими методами. Как это делается, мы рассмотрим на конкретном примере из области ферментативных кинетических методов. [c.500]

При изучении механизмов реакций в химии широко применяется кинетический метод. Попытки использования этого метода для исследования процессов, катализируемых ферментами, предпринимались еще в начале нашего века. Однако лишь в последние десятилетия кинетика ферментативного катализа развилась в самостоятельное научное направление со своими задачами и методами. Разумеется, здесь пока еще больше нерешенных проблем, чем законченных теорий. Однако уже теперь вырисовываются интересные перспективы применения методов ферментативной кинетики как в области теории механизма действия ферментов, так и при изучении взаимодействия с ферментами биологически активных веществ,-имеющих практическое значение (лекарственные препараты, гербициды, инсектициды и т. п.). В соответствии с этим настоящая книга имеет две задачи — осветить в сравнительно сжатой форме теоретические основы кинетики ферментативного катализа и проанализировать возможности и пути практического использования кинетического метода в изучении механизма действия ферментов. [c.3]

Современные кинетические методы позволяют устанавливать последовательность стадий ферментативных процессов, измерять константы скоростей отдельных стадий в интервале с , изучать механизмы элементарных стадий и оценивать термодинамическую возможность их протекания. [c.485]

Эффективность процесса получения сахаров зависит от ряда других факторов и в значительной степени — от стабильности ферментов, роли ингибирующего влияния на них продуктов, а также конструкции установки, в которой процесс реализуется Поэтому возникает задача обобщения кинетических закономерностей ферментативной деструкции целлюлозы, разработки математических моделей, отражающих кинетику, механизм и количественные характеристики происходящих процессов, в том числе с учетом особенностей функционирования реакторов разной конструкции Решение этой задачи с применением методов математического моделирования на ЭВМ позволяет осуществлять оптимизацию биотехнологических процессов ферментативной конверсии полисахаридов, корректно и оперативно планировать и прогнозировать их результаты, учитьшать количественный вклад каждого из факторов, влияющих на эффективность процесса, определять пути воздействия на них, приводящих к положительным результатам [c.5]

Кинетические методы (в том числе и ферментативные) при условии строгого соблюдения условий проведения анализа не уступают другим методам по точности, достаточно экспрессны, легко поддаются автоматизации. В практике аналитической химии эти методы применяют [c.276]

В химии ферментов ситуация не менее сложна, чем в такого рода процессах. Однако и здесь сохраняется принцип взаимозависимости скорости реакций, химических свойств и строения реагирующих веществ. Применение кинетического метода как в химии, так и в энзимологии зиждется на этом фундаментальном принципе, развитие которого в связи с созданием теории абсолютных скоростей и привело к возможности расчета скорости реакции для веществ с известным химическим строением. Такие расчеты удается, однако, пока провести для относительно простых по структуре веществ и простых механизмов реакции. Возможности приложения теории абсолютных скоростей к ферментативным реакциям еще менее изучены. [c.8]

Кинетический метод применительно к ферментативным реакциям имеет еще одно важное преимущество. Дело в том, что сложной проблемой энзимологии является выделение ферментов из биологического материала и их очистка вплоть до индивидуального состояния. Более того, не всегда могут быть точными критерии индивидуальности фермента. Все это в значительной мере затрудняет применение методов, обычно используемых в физической химии (например, спектральных и др.), при исследовании механизмов ферментативных реакций. [c.8]

Как уже указывалось, любая ферментативная реакция представляет собой цепь последовательных процессов, каждое звено которой характеризуется собственной константой скорости, значениями энергии активации и пространственного фактора. Поэтому, определяя экспериментально стационарную скорость ферментативной реакции при разных температурах и вычисляя по этим данным энергии активации, исследователь часто получает фиктивную величину — значение кажущейся энергии активации, которое трудно отнести к какой-то определенной стадии реакции. По этим причинам при изучении температурной зависимости результирующей скорости ферментативного процесса оказывается невозможным вычисление предэкспоненциального множителя и пространственного фактора. Все это приводит к настоятельной необходимости разработки специальных методов ферментативной кинетики, позволяющих вычислять константы скорости отдельных стадий процесса и на основе изучения их зависимости от температуры рассчитывать другие кинетические константы. [c.24]

В последнее время появились экспериментальные возможности выделения и изучения некоторых промежуточных продуктов ферментативных реакций, например ацильных производных ферментов гидролиза сложных эфиров (трипсин, химотрипсин и пр.) и некоторых других. Однако в области исследования фермент-субстратных комплексов кинетический метод пока, пожалуй, единственно реальный. [c.50]

Уравнение (Vni. 15) было впервые получено эмпирически Анри I6] и носит его имя. Удобный метод его использования для графического определения кинетических констант ферментативной реакции по экспериментальным данным зависимости х от t был предложен Уокером и Шмидтом [7]. [c.100]

Во второй части книги мы рассмотрели методы, с помощью которых можно выяснить формально-кинетический механизм ферментативной реакции, а в гл.Х и XI — методы, позволяющие установить число и тип кинетически значимых промежуточных соединений. Такого рода исследования позволяют оценить некоторые константы скорости и константы равновесия при определенных условиях реакции. Дальнейшая задача состоит в том, чтобы использовать эти данные для выявления тех особых химических свойств фермента, которые проявляются на каждой индивидуальной стадии процесса. Один из самых главных вопросов, который может быть исследован экспериментально, касается качественной оценки вызываемых ферментом изменений распределения электронов в молекуле субстрата. [c.191]

Кинетические методы анализа приобретают все более важное значение особенно в изучении ферментативных реакций. Серийно выпускается несколько спектрофотометров, либо специально предназначенных для кинетических исследований, либо являющихся модификацией стандартных спектрофотометров с соответствующими присно соблениями для программирования процесса измерений. [c.162]

Проблемы и перспективы применения ферментов в анализе объектов окружающей среды рассмотрены в ряде обзоров [83-85 и монофафий 4,86) В принципе использование ферментативных реакций является частным случаем кинетических методов анализа, основанных на измерении скорости индикаторной каталитической реакции в присутствии различных количеств определяемых веществ Для правитьного применения 2ХХ [c.288]

Материал, собранный во второй части книги, ни в коей мере не следует считать систематическим изложением многогранного кинетического метода в приложении его к ферментативному катализу. Это скорее всего попытка рационального отбора наиболее распространенных и оправдавших себя подходов к изучению структуры активного центра и механизма действия ферментов. Они изложены в весьма сжатой форме, которую, однако, легко раскрыть в ходе семинарских занятий. Все примеры, иллюстрируюш,ие отдельные теоретические положения, отобраны из непосредственных экспериментальных данных для широкого круга ферментов. [c.171]

Проводя кинетический анализ (6.52) обычным способом (методом установившихся равновесий при [51о, П о, [121о [Е],,), кинетические параметры ферментативной реакции можно записать следующим образом [c.230]

Бэн( )илд [21] предложил оригинальный метод определения кинетических параметров ферментативных реакций, основанный на определении площади под кинетической кривой в координатах ([S],/). Повторное интегрирование интегральной ( )ормы уравнения скорости ферментативной реакции (6.134) в пределах (О, [S]o) приводит к уравнению [c.249]

Настоящее пособие — первое в мировой литературе учебное руководство по анализу и обработке кинетических данных ферментативных реакций. В первой части курса наложены методы анализа кинетических закономерностей простых химических реакций, изуче-иие их необходимо для дальнейшего понимания кинетики и механизма действия ферментов. Во второй части книги рассмотрены методы обработки кинетических данных ферментативных реакций-Особое внимание здесь уделено новым- подходам, не нашедшим до последнего времени отражения в учебной литературе (новые методы нахождения элементарных констант, влияние диффузии на кинетику действия иммобилизованных ферментов, использование интегральных форм кинетических уравнений и др.). Каждая глава сопровождается О ригинальными задачами с подробными решениями. [c.2]

Наибольший интерес представляют кинетическое описание протяженных кривых ферментативной деградации полимеров и выявление соответствующих кинетических закономерностей. С этим вплотную связана проблема разработки методов оценки биополимеров с точки зрения их атакуемости ферментами, а также в отношении оценки перевариваемости белков протеазами [22—25]. Иэ немногочисленных количественных данных в литературе по ферментативной деградации биополимеров видно, что для них свойственно ингибирование низкомолекулярньши продуктами реакции (см. [22, 26—32]), При этом в большинстве случаев выводы об ингибировании продуктами были сделаны при кинетическом анализе так называемых полных кривых ферментативной деградации биополимера, или протяженных участков кинетических кривых, с помощью известных методов ферментативной кинетики (например, используя интегральную форму уравнения скорости, см. [21]). В ряде случаев не исключена возможность некоторого действия ингибирования продуктами так, в работе [33] выдвинуто и обосновано положение, что формально-кинетический анализ протяженных участков кинетических кривых ферментативной деградации полимеров практически неизбежно приводит к кажущимся эффектам ингибирования продуктами, даже если продукты не связываются с ферментом и ингибирование на самом деле отсутствует. Этот эффект наблюдается для ферментов, реакционная способность которых уменьшается при увеличении степени конверсии полимерного субстрата (за счет уменьшения степени полимеризации субстрата или доли наиболее реакционноспособных (доступных) связей в молекуле полимера). Подобные ферменты составляют подавляющее большинство ферментов-деполимераз (см. табл. 1). [c.30]

Чаще всего для анализа кинетических схем ферментативного катализа используют метод стационарных концентраций (к 1). Применение этого метода к простейшей схеме катализа дает уравнение Михаэлиса-Мешпен [c.224]

Исследования влияния углеводородов на конформационное состояние макромолекул глобулярных белков проводились методами оптического вращения и его дисперсии, вискозиметрически, спектрофотометрически и по изучению кинетических параметров ферментативной активности, Вращение плоскости поляризации чрезвычайно чувствительно к изменению конформации белковых молекул. Правда, между оптической активностью и структурой белка нет простой и ясной зависимости, но значение оптической активности как характеристики степени конформационного изменения белков общеизвестно и играет большую роль при изучении процессов денатурации. [c.29]

Кинетические методы предусматривают инициирование химической реакции и последуюш,ее наблюдение за ее развитием во времени. Метод часто используется при определении дегидрогеназ человека [12]. Одним из наиболее важных соединений этого класса является а-гидроксибутиратдегидрогеназа (GBD), измерение концентрации которой в сыворотке крови проводится при диагностике инфаркта миокарда. Авторами работ [13, 14] предложен метод определения концентрации GBD при по.мощп специального спектрофотометра, называемого анализатором скорости реакции. Принцип метода заключается в следующем GBD катализирует реакцию (субстрат +МАО продукт + -fNADH-f-H+ (где NAD — р-никотинамидадениндинуклеотид) следовательно, скорость этой реакции, которая может контролироваться по интенсивности поглощения при 340 нм, является мерой ферментативной активности и соответственно концентрации. В прибор помещают одиовремепио до 16 образцов, где они последовательно автоматически анализируются. Результаты могут быть либо представлены в виде графика (и тогда их обработку проводит сам экспериментатор), либо переданы в компьютер (через соответствующий электрический интерфейс) для автоматической обработки. [c.28]

В энзиматической кинетике статистические методы не находят повседневного применения, а между тем, как показывают результаты даже немногих работ в этой областй, без них нельзя с достаточной уверенностью воспринимать публикуемые кинетические константы ферментативных реакций. Особенно нужен такой анализ при сравнении не сильно различающихся по величине констант субстратов близкого строения, когда необходимо сопоставление изменений в структуре с изменениями кинетической характеристики. [c.45]

Дальнейшее развитие теория стационарной кинетики получила в недавнее время в работах Клеланда [4],. который систематизировал многочисленные механизмы ферментативных реакций, вывел уравнения для зависимости стационарной скорости реакции от концентраций реагирующих веществ и значений кинетических параметров. Исследование механизма двухсубстратных реакций кинетическим методом дано в работе Фромма [5]. Громоздкость расчетов кинетических параметров для сложных реакций и необходимость статистического их анализа привели к необходимости использования в ферментативной кинетике счетно-решающих машин. Первые опыты составления программ для этих машин и решения некоторых [c.76]

В работе А. П. Бресткина и сотрудников [4] проверена применимость изложенного метода к кинетическому анализу ферментативного гидролиза монофенил фосфата, катализируемого щелочной фосфатазой (фосфогидролаза моноэфиров ортофосфата, КФ 3.1.3.1). В соответствии с уравнением (УП1.12), скорость гидролиза линейно зависела от концентрации фермента (использован кристаллический препарат фосфатазы). Фермент ингибировался избытком субстрата, причем [5]опт. в соответствии с уравнением (УП1.13), не зависела от концентрации фермента и была равна 4,3-10 М. Уста- [c.97]

Ф. м. а. можно условно подразделить на два вида 1) методы, основанные на количественном определении компонентов ферментативной реакции (исходных веществ или продуктов) после ее заверше-нт1я 2) методы, основанные на измерении скорости ферментативной реакции, или кинетические методы. [c.205]

Кинетические методы основаны на завнсимости скорости ферментативных реакций от концентрации субстратов и фермента, а также присутствующих в среде активаторов или ингибиторов. Если анализируемым веществом является субетрат ферментативной реакции, то для определения его концентрации не обязательно доводить реакцию до конца и достаточно определить любым методом начальную скорость реакции, к-рая при прочих равных условиях (концентрация фермента, второго субстрата, величина pH, темп-ра и т. д.) зависит от концентраций этого вещества. Характер этой зависимости определяется законами ферментативной кинетики (см. Ферменты, Михаэлиса константа), он может быть найден эмпирически п выражен в форме калибровочного графика, используемого для нахождения концентрации определяемого вещества по найденной экспериментально скоростп ферментативной реакции. Любой из приведенных выше прямых Ф. м. а. с участием одной ферментативной реакции может быть использован как кинетич. метод. Если же применяется комбинация из нескольких реакций, то скорость индикаторной реакции может служить мерой концентрации субстрата первой вспомогательной реакции в том случае, если предварительно эта реакция доводится до конца. [c.206]

Можно определять активность АХЭ или ХЭ. Для определения активности АХЭ в большинстве случаев подвергают гемолизу эритроциты ХЭ определяют в сыворотке крови. При использовании цельной крови можно путем выбора специфического субстрата (ацетил-р-метилхолина для АХЭ и бутирилхолина для ХЭ) или применяя определенные концентрации субстрата достигнуть дифференцирования ферментов. Последний из указанных способов основан на уже описанном ингибировании АХЭ более высокими концентрациями субстрата. Так, при концентрации ацетилхолина 10 М определяется преимущественно АХЭ, при концентрации же 10 М — ХЭ, однако в каждом случае в определенной степени (примерно на /б) проявляет активность и другой фермент. Определение активности осуществляют либо по установлению скорости ферментативного расщепления субстрата (кинетический метод) или путем определения конечных продуктов" и не вступившего в реакцию субстрата. [c.165]

Основное достоинство книги Уэстли — последовательное изложение теории и методов ферментативной кинетики, начиная от простых односубстратных реакций и кончая сложными полиферментными системами. Автор, имеющий немалый опыт собственных кинетических [c.5]

Существуют и другие методы определения состава энантиомерных смесей, в том числе изотопное разбавление, кинетическое расщепление, ферментативные пробы, микрокалориметрические методы, а также ЯМР-спектроскония в хиральных растворителях [3]. Высокоэффективный метод анализа результатов асимметрических реакций основан на разделении смесей энантиомеров с помощью газовой хроматографии. Сравнение площадей соответствующих пиков позволит точно установить состэл энантиомерной смеси (э. ч.). Этим методом можно исследовать очень малые образцы величина оптического вращения и наличие примесей не оказывают влияния на результаты анализа. [c.78]