Ферменты потенциометрическое

К данной группе относят специальные устройства, которые состоят из индикаторного электрода и соединенного с ним гидрофильного слоя, содержащего биокатализатор (ферменты, бактерии, грибы, ткани растений и животных и т.п.). Многие биосенсоры содержат еще и полупроницаемую мембрану. Принцип их действия основан на диффузии определяемого вещества в тонкий слой биокатализатора, в котором протекает индикаторная реакция. При этом определяемое вещество (хотя и не всегда) превращается в форму, пригодную для регистрации потенциометрического сигнала. В качестве биокатализаторов обычно используют ферменты. Можно применять также химические реакции, протекающие в клетках, липосомах или в срезе биологической ткани, прикрепленной к индикаторному электроду. [c.213]

Для определения активности холинэстеразы разработано много способов. Надежные результаты дают методы, основанные на определении количества образующегося продукта, в которых соблюдается линейная зависимость между активностью фермента и количеством образующегося продукта. Несмотря на то, что манометрический метод довольно сложен в выполнении, он в этом отношении (соблюдение линейной зависимости) еще не превзойден. Более простыми являются потенциометрические методы, которые дают весьма точные результаты, особенно при использовании автотитратора, автот матически поддерживающего постоянный pH, вследствие чего исключается влияние pH на активность фермента. Ниже приведен (см. также табл. 10) обзор различных способов определения активности фермента. Подробно описаны манометрический и потенциометрический способы как наиболее пригодные. [c.166]

В настоящее время в ферментных электродах в качестве электрохимических датчиков применяют платиновые, серебряные, графитовые, различные ионоселективные и газочувствительные электроды. При контакте фермента с исследуемым веществом в приэлектродном слое происходит ферментативная реакция. Если продукт этой реакции (иногда определяемое вещество) электрохимически активен, то по изменению потенциала (или тока) электрода можно судить о количестве определяемого вещества. Классический потенциометрический ферментный электрод представляет собой комбинацию ионоселективного электрода с ферментом, который обеспечивает селективность и чувствительность определений конкретного субстрата. [c.214]

Описаны многочисленные конструкции потенциометрических и амперометрических холинэстеразных биосенсоров [84 . В частности, интерес представляст потенциометрическая система на основе двух платиновых электродов. Измеряемой величиной является потенциал одного из элекфодов, который служит анодом В ячейку вносят раствор бутирил-тиохолиниодида (0,002 моль/л) с pH 7,4. При введении в раствор аликвоты пробы, содержащей холинэстеразу, потенциал анода понижается, причем скорость его изменения АЕ/А1 зависит от природы фермента и концентрации фосфорорганических веществ (систокс, паратион, зарин и др.) в растворе. Пределы обнаружения составляют для зарина - 0,0002, систокса - 0,01 и паратиона - 0,18 мкг/мл. Погрешность определений - [c.293]

Применение ферментов - уникальных биологических катализаторов - для создания потенциометрических датчиков определяет- [c.213]

В табл. 6,6 приведены характеристики некоторых потенциометрических ферментных электродов. Среди них наибольщее распространение получили электроды для определения мочевины (диагностический показатель функции печени). В качестве базового электрода применяют стеклянный электрод, чувствительный к ионам аммония. Уреазу закрепляют на поверхности электрода нанесением слоя полиакриламидного геля, содержащего фермент, или с помощью целлофановой мембраны. Слой геля удерживается на поверхности с помощью нейлоновой сетки. Если такой электрод опустить в раствор, содержащий мочевину, то она диффундирует в слой фермента, в котором происходит ферментативный гидролиз мочевины с образованием ионов аммония в результате протекания реакции [c.215]

Конструктивно потенциометрические ферментные редокс-электроды весьма просты. Однако в системах, в которых в реакцию вступает большое количество субстрата, могут возникнуть проблемы, связанные с загрязнением поверхности электрода продуктами ферментативной реакции и отсутствием механизма регенерации фермента. Величина сигнала зависит также от способа предварительной обработки поверхности электрода. Вероятно, потребуются значительные усилия ученых и специалистов, прежде чем ферментные редокс-электроды можно будет рекомендовать для использования в практических целях. [c.217]

Применяются также потенциометрические бактериальные электроды. В электродах данного типа обычно используются газочувствительные электроды. При этом между индикаторным электродом и мембраной помещают слой бактерий, под действием которых определяемое вещество превращается в газообразный продукт, к которому чувствителен электрод. При помощи таких электродов можно определять аргинин, глутамин, нитрат-ионы, L-гис-тидин. В гибридных бактериально-ферментных электродах специфическая химическая реакция осуществляется с участием бактерий и фермента одновременно. [c.217]

Сущность этого метода состоит в следующем. В систему, содержащую фермент и субстрат, вводят ингибитор в концентрации, существенно превышающей концентрации фермента, и измеряют кинетику ферментативной реакции по скорости превращения субстрата или образования продукта. При этом наиболее удобны методы измерения ферментативной кинетики, основанные не на отборе проб по времени и их анализе, а такие, которые позволяют непрерывное измерение скорости процесса в реагирующей системе (например, спектрофотометрические, потенциометрические и т. п. методы). При этом целесообразны такие условия эксперимента, когда реакция в отсутствие ингибитора имеет нулевой порядок. Тогда в отсутствие ингибитора ход ферментативной реакции выражается прямой (рис. 27, 1), тангенс угла наклона которой представляет скорость (и) процесса. Если в момент времени и в систему введен ингибитор, то скорость ферментативной реакции постепенно будет падать, причем для бимолекулярной реакции с избытком ингибитора это падение выражается экспоненциальной кривой (рис. 27, 2). Скорость ферментативной реакции (у / ) в присутствии ингибитора для любого момента времени (принимая и за нуль) может быть найдена как тангенс наклона касательной к кривой 2 = = tg 02. Расчет константы скорости взаимодействия фермента с ингибитором может быть проведен по уравнению [c.117]

Вторым направлением развития метода потенциометрического титрования является создание способа поддержания в ходе ферментативной реакции постоянства концентрации субстрата в реакционной среде. Необходимость такого метода диктуется особенностями кинетики реакций, катализируемых ацетилхолинэстеразой и некоторыми другими ферментами, активность которых тормозится уже при сравнительно низких концентрациях субстрата. Прн изучении кинетики таких реакций во избежание субстратного торможения приходится работать в области концентраций, не достигающих насыщения фермента. С другой стороны, при высокой молекулярной активности фермента (как, например, в случае ацетилхолинэстеразы) это приводит к быстрому снижению концентрации субстрата и переходу из кинетической области нулевого порядка к мономолекулярной, что затрудняет вычисление начальной скорости реакции. [c.152]

Кинетика взаимодействия ФОС с холинэстеразой сыворотки крови лошади (очищенный препарат фермента) изучалась потенциометрическим методом при условии избытка ингибитора по отношению к ферменту в присутствии ацетилхолина в концентрации 7,5-10 при постоянном значении pH 8,0. Скорости реакции измерены в интервале температур 15—40° С. Бимолекулярные константы скорости рассчитывались по уравнению [c.206]

Многие фирмы выпускают проточные клинические анализаторы метаболитов и ферментов, и их прежде всего стали приспосабливать для работы не с растворимыми, как раньше, а с иммобилизованными ферментами. Метод регистрации продукта реакции оставался прежним (либо спектрофотометрическим — для цветных индикаторных реакций, либо электрохимическим — при использовании потенциометрических или амперометрических датчиков). Были предложены самые разнообразные реакторы с иммобилизованными ферментами — в виде колонок, трубок, полых нитей. Для заполнения колонок использовали ферменты, ковалентно связанные с аминированным стеклом, акриловыми полимерами, агарозой или сефарозой, найлоновым порошком, силикагелем, силохромом и др. Основное требование к носителям — это способность связывать наибольшее количество фермента, обеспечивать быстрое прохождение анализируемой смеси через реактор и отсутствие сильной неспецифической сорбции компонентов анализируемой смеси на носителе, поскольку это может приводить к падению активности фермента и к увеличению давления в колонке. [c.88]

Потенциометрические ферментные электроды были предложены для определения аминокислот, мочевины, нитрат- и нитрит-ионов, пенициллина. В качестве ферментов в них использовались оксидазы или декарбоксилазы аминокислот, уреаза, нитрит- [c.92]

В потенциометрическом иммуноанализе впервые в качестве ферментной метки применили уреазу. Этот фермент катализирует превращение мочевины в аммиак и диоксид углерода [c.209]

Рассматривая ферменты как специфические химические преобразователи, переводящие определяемое вещество в форму, детектируемую физическими или химическими методами, удалось придумать и разработать новый класс сенсоров, для которых характерна чувствительность к биологическим соединениям. Перспективным путем повышения селективности и чувствительности и расширения возможностей этих устройств является комбинирование различных ферментов, например эстераз, дегидрогеназ и оксидаз с детекторами-полярографическими, кондуктометрическими, потенциометрическими, акустическими и оптическими. Б первых ферментных электродах ферменты физически удерживались на поверхности сенсора или в непосредственной близости от нее. Позже были предложены методы химической иммобилизации, осаждения и другие. Коферменты также физически или химически закрепляются на поверхности сенсора. Перевод фермента в нерастворимую форму как способ увеличения его времени жизни позволяют избежать осложнений, связанных с осмотическими явлениями в коллоидных растворах, особенно когда в ферментном электроде используется проницаемая для определяемого компонента мембрана В идеальном случае ферментный биосенсор должен работать непосредственно в неразбавленной цельной крови, подобно газовым и рН-электродам, в свое время произведшим революцию в анализе. [c.11]

В данную группу сенсоров входят специальные устройства (см. разд. 3.4), состоящие из внутреннего ионоселективного электрода (обычно стеклянного) и соединенного с ним активного гидрофильного слоя. В этом слое один из компонентов анализируемого раствора (как правило, определяемое вещество, хотя и не всегда) превращается в форму, пригодную для потенциометрического измерения при помощи внутреннего ИСЭ. В качестве специфических химических реакций, лежащих в основе работы биосенсоров, обычно используют ферментативные реакции, которые проходят в гидрофильной мембране, содержащей подходящим способом иммобилизированный фермент. Можно применять также биохимические реакции, протекающие непосредственно в клетках или в моделях клеток, липосомах, которые иммобилизированы в тонком слое, прилетающем к ИСЭ, или, наконец, реакции в срезе биологической ткани, прикрепленном к ИСЭ (разд. 8.2). Активный ферментный слой непосредственно контактирует с ИСЭ, как, например, в ферментном электроде (разд. 8.1), или располагается в проточной системе таким образом, чтобы исследуемый раствор вначале соприкасался с слоем иммобилизированного фермента, а затем образующийся продукт реакции определялся при помощи проточного ИСЭ. В последнем случае речь идет об электроде с ферментным реактором [29] (рис. 8.1). ИСЭ можно также применять для определения продуктов ферментативных реакций, происходящих в гомогенной среде. Однако такой случай здесь рассматриваться не будет. [c.238]

Классический потенциометрический ферментный электрод представляет собой комбинацию ИСЭ с иммобилизованным (нерастворимым) ферментом, который обеспечивает высокую селективность и чувствительность определения конкретного субстрата. В табл. 9.1 перечислены некоторые ИСЭ, пригодные для конструирования ферментных [c.120]

Потенциометрический датчик Субстрат/фермент [c.120]

Считают, что в водном растворе образование оксида платины начинается с обратимого присоединения ОН-групп к поверхностному слою атомов платины. При примерно монослойном покрытии внешние слои платины подвергаются необратимой перестройке, в результате чего ОН-группы входят в кристаллическую решетку платины [6]. Точно не известно, какой именно одноэлектронный процесс имеет место при окислении платины. Таким процессом может быть восстановление части платины через промежуточное состояние окисления + 1. Влияние pH на измеряемые потенциалы непосредственно не изучалось, поскольку изменение pH раствора очень сильно влияет на активность ферментов. Однако варьирование pH между 5,4 и 8,4 не оказывает заметного влияния на потенциал голого (в отсутствие фермента) платинового электрода. Очевидно, чтобы объяснить, как возникает потенциометрический сигнал на платине, необходимо лучше понять химические процессы в системе платина - кислород-вода-пероксид водорода. [c.136]

Простейший ферментный электрод включает находящийся в непосредственной близости к активной поверхности преобразователя тонкий слой фермента (или ферментов), подходящий электрод сравнения и цепь для измерения либо разности потенциалов между двумя электродами (потенциометрия), либо протекающего между ними тока (амперометрия). Обычно электрод покрывают мембраной, которая служит для защиты его от загрязнения и/или благодаря которой происходит распределение частиц на границе раздела фаз. При измерениях ферментный электрод просто погружают в раствор, содержащий определяемое вещество, и считывают стационарный ток или потенциал. Для амперометрического электрода амплитуда сигнала и концентрация связаны линейной зависимостью для потенциометрического электрода-логарифмической. [c.211]

В разд. 7.3 показаны другие системы погенциометрического измерения, которые могут быть пригодными для сочетания с ферментативными реакциями. Рассмотрите различные классы ферментов и определите, какие из них пригодны для потенциометрического анализа. [c.546]

Если твердый цианидселективный электрод обернуть пленкой из геля акриламида, содержащего р-глюкозидазу, и опустить его в раствор амигдалина, то последний реагирует с ферментом, образуя H N, которую можно изменить потенциометрически. [c.388]

Указанное взаимодействие подтвердилось потенциометрическим исследованием [27], причем после прибавления к носителю соответствующего иона (водный раствор соли) наблюдалось четкое измекение потенциала. Среди многих комбинаций носителя и ионов (последние нужно понимать как простетическую группу) найдено большое количество ценных и специфически действующих редокс-ферментов, которые по своему действию в несколько раз выше знаменитых прежде однокомпоиептных ферментов Бредига [28]. Так, например, составы Al(OH)з/ o -+ и 2п(ОН)г/Со++ представляют собой отличные модели пероксидазы, но лишены каталитических свойств. Ион Со++ ведет себя совсем по другому, когда находится на носителе Mg(0H)2. Возможно, что различное пове- [c.387]

Большое различие е действии тиолов на центральную нервную систему обусловливает интерес к исследованию их влияния на основные ферментные системы мозговой ткани. В литературе отсутствуют данные о действии меркаптанов на активность холинэстеразы. Определение активности хо-линэстеразы производилось нами потенциометрическим методом, основанном на появлении уксусной кислоты при гидролизе ацетилхолина [121. Исследуемые меркаптаны вводились крысам внутрибрюшинно в дозах, близких к ДЛ5,,. На васоте отравления определялась активность данного фермента в головном мозгу, плазме крови и эритроцитах (табл. 6). [c.556]

Михаэлиса для четырех известных субстратов одним и тем же методом и при строго одинаковых условиях [71]. Исследована кинетика ферментативного гидролиза ацетилхолина, ацетил-Р-метил-холина, бутирилхолина и бензоилхолина, катализируемого холинэстеразой сыворотки крови лошади (очищенный препарат фермента с уд. активностью по ацетилхолину 4,3 Е/мг при температуре 25°, pH 8,0 и концентрации Na l в среде 6,05 М). Для измерения начальной скорости реакции использован потенциометрический метод с регистрирующим рН-метром. [c.160]

Титриметрическое определение уксусной кислоты, образующейся при расщеплении ацетилхолина, с феноловым красным в качестве индикатора используется для определения табуна и зарина в концентрации 0,1 мкг/мл, а с крезоловым красным — для определения инсектицидов Многие авторы применяют АрН-метод. Наиболее подходящим для контролирования протекающих очень быстро процессов ингибирования действия ферментов, например в случае расщепления метилфторфосфорилхолинов, является потенциометрический метод, при котором постоянное значение pH поддерживается автотитратором. Очень важно, что по этому методу можно работать без добавл ения буфера. Таким образом исключается присутствие различных ионов, которые в известной мере влияют на действие ферментов. [c.176]

Изучение удивительной по эффективности кметнческой роли ферментов л 0с)лцествлении определенных реакций служит прогрессу в понимании гомогенных редокс-взаимодействий, в том числе развитшо кинетических методов анализа с потенциометрическим контролем (раздел 11.2), в использовании медиаторов. [c.136]

Определение ферментативной активности иммобилизован ного трипсина. Определение проводят, измеряя скорость ферментативного гидролиза этилового эфира N-бeнзoил-L-apгининa, потенциометрически на рН-стате. Для этого из инкубационной смеси отбирают пробы по 0,5—1,0 мл и помещают в ячейку рН-стата, содержащую 10 М субстрата (pH около 7), 0,1 М КС1 и 10 мМ СаСЬ- Измеряют активность отобранных проб, учитывая фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие фермента. [c.148]

Определение активности иммобилизованного а-химотрипси-на. Определение проводят потенциометрически, измеряя скорость ферментативного гидролиза специфического субстрата этилового эфира Ы-ацетил-Ь-тирозина на рН-стате. Для этого навеску иммобилизованного фермента (0,05—1,0 г) помёш,ают в ячейку рН-стата с 5—10 мл 5 мМ раствора субстрата в 0,1 М КС1 (pH 8,0) и измеряют активность препарата фермента, учитывая фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие фермента. [c.149]

В кювету объемом 20 мл вносят 2 мл взвеси митохондрий, 3,9 мл 0,45 М раствора КС1 и 0,1 мл 60 мМ раствора АМФ. Смесь быстро перемешивают и начинают измерения и запись pH. Учитывая измене ние pH среды,-время реакции и буферную емкость инкубационной смеси, рассчитывают скорость реакции и удельную активность фермента. На рис. 3 приведен пример записи реакции дезаминирования адениловой кислоты (АМФ) митохондриями печени крысы. 1 ельная активность аденилатдезаминазы. рассчитанная по кривой за первые 15 мин реакции, равна 1,8 нмоля NHg на мг белка в 1 мин. Активность, измеренная в этой же пробе путем определения аммиака методом Конвея, составила 1,6 нмоля NHs на мг белка в I мин. При сравнении результатов потенциометрического метода со спектрографическим (Kalkar, 1947) было получено полное совпадение. [c.41]

До сих пор все представляющие интерес для изготовления биосенсоров ткани использовались в сочетании с потенциометрическим аммиачным мембранным электродом. В работе [32] был впервые описан амперометрический тканевый биосенсор, в котором слой ткани печени быка иммобилизовали на датчике, чувствительном к кислороду, и определяли пероксид водорода. Печень быка содержит значительное количество фермента каталазы, который катализирует реакцию 2Н2О2 - Oj -Ь 2Н2О. Образование кислорода контролируется амперометрически. [c.47]

К счастью, потенциометрические методы иммуноферментного анализа не обязательно являются гетерогенными по своей сути. Гомогенные методы удобнее, чем гетерогенные, так как включают меньшее число операций. Фононг и Рехнитц [6] описали метод гомогенного потенциометрического иммуноферментного анализа для человеческого иммуноглобулина О с использованием СО2-электрода. В этом методе получают конъюгат IgG, меченный ферментом, и затем ингибируют активность последнего, связывая конъюгат с антителами к IgG. Используемая ферментная метка, хлоропероксидаза, несколько необычна. Это гем-содержащий фермент, который катализирует ряд реакций галогенирования органических молекул в присутствии пероксида водорода и соответствующего галогенида, например бромирования (3-кетоадипиновой кислоты. Этот процесс сопровождается образованием СО2, что и используют в данном аналитическом методе [c.62]

Глюкозооксидазу (в чистом виде или в смеси с каталазой) иммобилизуют на платине, пористом графите или золоте. Такая система дает непосредственный потенциометрический сигнал в растворах глюкозы при pH 7,4. Методика приготовления может быть, например, следующей. В буферном растворе фосфата натрия (pH 7,4) смешивают каталазу, лиофилизованную глюкозооксидазу из А. тдег, бычий сывороточный альбумин и глутаровый альдегид. Смесь выливают в формочку, в которой находится диск из платиновой фольги толщиной 0,05 мм. Толщину поперечно-сшптой фермент-альбуминовой матрицы можно менять с помощью прокладок на дне формы, например от 0,05 до 0,32 см. При комнатной температуре сшивка белков глутаровым альдегидом длится 2 ч. Перед проверкой ферментативной активности или потенциометрическими измерениями сшитый глутаровым альдегидом слой отмывают буферным раствором в течение 1-2 дней, чтобы удалить слабосвязанный фермент [11]. [c.134]

При прямых потенциометрических измерениях глюкозооксидазный электрод и А /А С1 электрод сравнения погружают в насыщенный кислородом раствор глюкозы, pH которого поддерживают в пределах от 6,0 + 0,1 до 7,5 + 0,1 с помощью 0,1 М буферного раствора фосфата натрия. Потенциалы можно измерять любым подходящим потенциометром, например Ке11Ыеу 6 ЮС. На рис. 10.4 приведены типичные результаты для ферментного слоя различной толщины, нанесенного на одну сторону платинового диска. При удалении покрытого ферментом платинового диска из формочки ферментный слой получается очень тонким ( 0,02 см). Если же диск находится в формочке, толщина ферментного слоя составляет 0,05-0,24 см. Как видно [c.134]

В настоящее время, по-видимому, единственный практический способ устранения их недостатков-это разработка методов электрохимического иммуноферментного [ализа, как потенциометрических, так и амперометрических. Образование комплекса [тиген - антитело проводят вне сенсорной системы. После завершения инкубационно- периода добавляют субстрат фермента-маркера и с помощью сенсора следят за оростью превращения субстрата, используя щелочную фосфатазу в качестве фер- нта-маркера, глюкозо-6-фосфат как субстрат и сенсор глюкозы. При помощи lukometer можно определить от 1,6 до 16 нг фактора VIII, связанного с антигеном в 1азме крови человека [52]. [c.275]

Что касается применения кондуктометрии в биосенсорах вообще, авторы [13, 134, 135] недавно подчеркнули, что большинство реакций, используемых в потенциометрических и амперометрических ферментных электродах, например зависимые от концентрации мочевины изменения pH и р1 в электродах, содержащих уреазу, могут быть на том же уровне, или лучше, оценены кондуктометрически. Аналогично авторы [6] использовали связанные с ферментативной реакцией изменения емкости двойного электрического слоя симметричных металлических электродов как меру активности фермента или субстрата. Такие измерения стремятся проводить на одной частоте, не обсуждая вопрос о том, что в случае многочастотных измерегшй могли бы получиться более селективные и информативные сенсоры. [c.358]

Подавляющее большинство биосенсорных приборов, предложенных или реализованных к настоящему времени, основано на непосредственном соседстве фермента (или белка) и потенциометрического либо амперометрического электрода. Здесь хотелось бы обсудить возможность использования специфического нефарадеевского яли-нелинейного электрического поведения белков, связанных с электродами (или находящихся вблизи них). [c.365]

Первым из предложенных и до сих пор наиболее важныМ потенциометрическим ферментным электродом являлся элект-трод, чувствительный к мочевине. В первоначальном варианте в конструкцию электрода входил ферментный слой, состоящий из фермента (уреазы), иммобилизированного в матрице из полиакриламидного гидрофильного геля, который для повышения механической прочности фиксировался в найлоновой сетке. Ферментный слой закреплялся на стеклянном электроде Be kman 39137, чувствительном к ионам щелочных металлов и аммония [19, 24]. Вследствие недостаточной селективности стеклянного электрода в более поздних модификациях он был заменен на ЫН4+-селективный нонактиновый жидкостной электрод [20, 22] (ср. с. 229) и затем на аммиачный газочувствительный электрод [25] (ср. с. 92). Ферментный электрод последнего [c.239]

Другой важной областью применения иммобилизованных ферментов является производство аминокислот с помощью аминоацилазы. Колонки с амино-ацилазой используются в Японии для производства сотен килограммов Г-метионина, Г-фенилаланина, Г-триптофана и Г-валина. Ферментно-полимерные коньюгаты широко используются в аналитической и ьслинической химии. Иммобилизованные на колонках ферменты могут использоваться повторно в качестве специфических катализаторов при определении различных субстратов. Папример, разработаны ферментные электроды для потенциометрических и амперометрических определений таких веществ, как мочевина, аминокислоты, глюкоза, спирт и молочная кислота. [c.92]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология