Пероксидаза ферментативных реакция

Увеличение времени инкубации далеко не всегда приводит к повышению чувствительности определения. В каждом случае необходимо проверять, происходит ли при более длительной инкубации дальнейшее развитие окраски или ее ослабление, особенно в случае проведения реакции при повышенной температуре. Для уяснения вероятности ослабления окраски в ходе ферментативной реакции смесь стандартов с конъюгатом [пероксидаза — IgG] после завершения начальной фазы превращения субстрата длительно инкубировали при 25 и 37 °Q. Как видно на рис. 12-7, после 30 мин инкубации при 37 развитие окраски практически прекращается, в то время как при 25 С на этом же этапе окраска продолжает интенсивно нарастать. [c.181]

Из уравнения (3) следует, что [Е5] зависит от Кт и от [5]. Если в состоянии равновесия [Е5] будет бесконечно малой величиной по сравнению с [5] и с [Еоб ], то скорость реакции будет зависеть только от [8]. В этом случае при низких концентрациях субстрата эта реакция будет протекать по типу реакций первого порядка. Если же практически все количество фермента окажется связанным с субстратом в виде Е5 и если концентрация субстрата будет достаточно высока, то концентрация фермент-субстратного комплекса не будет меняться и скорость такой реакции окажется постоянной. В этом случае мы имеем дело с реакцией нулевого порядка [36]. Большинство ферментативных реакций не являются, строго говоря, ни реакциями первого, ни реакциями нулевого порядка, а протекают согласно некоему промежуточному порядку [34, 36, 37]. Это зависит отчасти от уменьшения концентрации субстрата в течение реакции, а отчасти от образования различных типов фермент-субстратных соединений. Так каталаза и пероксидаза, как уже указывалось выше, образуют зеленые и красные комплексы с субстратом, причем скорости распада зеленого и красного комплексов различны [32, 33]. Дальнейшие усложнения возникают вследствие соединения фермент-субстратных комплексов с водородными ионами [38] или с другими ионами или молекулами. Так, например, скорость гидролиза яичного альбумина пепсином зависит от концентрации водородных ионов раствора реактивным промежуточным соединением является в этом случае не Е5, а Н+Е5 [38]. Если в образовании фермент-субстратного соединения участвуют ионы, то скорость катализируемой реакции зависит от диэлектрической постоянной растворителя известно, что органические растворители, например метиловый или этиловый спирт, уменьшают диэлектрическую постоянную раствора и степень ионизации,вследствие чего уменьшается скорость катализируемой реакции [39]. [c.284]

Кислород может участвовать не только в ферментативной реакции, но и в реакции с радикалами субстрата. Последняя приводит к образованию гидроперекисного радикала, который далее превращается в молекулу гидроперекиси при отрыве водорода от молекулы субстрата. Образующаяся в реакции перекись водорода и гидроперекиси являются субстратами пероксидазы. Реакция их с ферментом приводит к образованию соединения I, которое далее взаимодействует с субстратом ДФК, инициирует образование дополнительных количеств радикалов ДН- в системе и способствует увеличению скорости окисления ДФК. При высоких концентрациях пероксидазы отмечается значительное возрастание скорости инициирования свободных радикалов. При этом увеличивается вероятность взаимодействия промежуточного соединения III со свободными радикалами. Эта реакция может быть причиной отклонения от линейной зависимости между скоростью реакции окисления ДФК и концентрацией пероксидазы, что отмечалось при высоких концентрациях фермента [Березин и др., 19756]. [c.34]

В живых организмах протекают различные химические реакции среди которых следует вьщелить окислительно-восстанови-тельные, продуктами этих реакций являются свободные радикалы. Для защиты от разрушительного действия свободных радикалов организмы используют компоненты антиоксидантной защиты в составе которых пероксидаза. Фермент способен катализировать оксидазные, оксигеназные и пероксидазные реакции. Сложное строение пероксидазы полипептидная цепь, гемин, кальций и поверхностные моносахариды, последние защищают апобелок от разрушительного действия свободных радикалов. При этом моносахариды располагаются вдалеке от активного центра и не влияют на каталитические свойства пероксидазы, но способны ориентировать фермент в мембранных структурах клетки и ее органелл. Как представитель гемсодержащих белков, пероксидаза способна катализировать реакции с участием перекиси водорода, восстанавливая последнюю до воды и при этом окисляя различные неорганические и органические соединения. Продуктами ферментативной реакции могут быть свободные радикалы или фермент-субстратный радикальный комплекс, эффективно окисляющий даже медленно окисляемые в индивидуальных реакциях субстраты. Для выполнения разнообразных каталитических функций на поверхности холофермента располагается протяженная субстратсвязывающая площадка, представленная двумя участками, где могут связываться субстраты гидрофобной и гидрофильной природы. Причем в месте локализации гидрофобных субстратов проявляется карбоксильная группа, модификация которой замедляет протекание каталитического процесса. рК этой группы может колебаться в пределах 4,5—5,5. [c.208]

Довольно похожие схемы были даны для катализа дегидразами и оксидазами, мутазой , глиоксалазой и пероксидазами. Уотерс [51 разработал цепные механизмы для некоторых ферментов, катализирующих окислительные процессы. На основании цепных механизмов очень трудно объяснить специфичность ферментов и кофер-ментов. Активность катализаторов или инициаторов цепных реакций в большой степени зависит от реакции, соответствующей большой длине цепи, т. е. большой величине отношения скорости роста цепи к скорости обрыва цепи. Если это наблюдается, то почти любое вещество, способное разлагаться с образованием свободных радикалов, которые могут инициировать цепи при умеренной скорости Rl, будет давать большую скорость цепной реакции, равную X (длина цепи). Трудно согласовать это неспецифическое поведение катализаторов свободнорадикальных цепных реакций со строго специфическим поведением ферментов. Кроме этого, до сих пор не было получено положительных доказательств существования свободных радикалов в ферментативных реакциях фактически же доказано, что свободные радикалы, (образованные, например, при облучении) уничтожают активность ферментов. Более того, имеются [c.110]

Для многих ферментативных реакций раздельное определение Кз и Км показало, что эти величины отличаются не очень сильно. Противоположная картина найдена только для ферментов разложения перекиси водорода. Для каталазы и пероксидазы 2 -1. благодаря чему [c.40]

Рис. 6-78. Электронная микрофотография (А) и схематическое изображение (Б) перинуклеарных эндосом из молодых клеток почек хомячка, растущих в культуре. Клетки инкубировали в среде, содержащей пероксидазу, 15 мин при 37°С, что вполне достаточно для поглощения пероксидазы путем жидкофазного эндоцитоза и переноса в эндосомы (и эидолизосомы, см. текст), но недостаточно для поступления в лизосомы После фиксации клеток и выдерживания их с субстратом пероксидазы (диаминобензидином) продукты ферментативной реакции фиксировали тетроксидом осмия для увеличения электроноплотности На (Б) изображена усредненная картина, полученная из 18 тонких срезов Ядро клетки

Фториды легко поглощаются организмом, выделяются же медленно, следовательно, они способны вызывать кумз лятивное отравление. Фториды служат энергичными ингибиторами многих ферментативных реакций. Например, значительное ингибирующее влияние фториды оказывают на гликолитические ферменты липаза, различные эстеразы, уреаза, костная фосфатаза, сукцииодегидрогеназа и каталаза — все они подвергаются ингибированию. Фториды сильно замедляют действие пероксидазы, содержащейся, как известно, в щитовидной железе., Поэтому можно ожидать, что отравление фторидами будет влиять на метаболизм вообще, включая и некоторые процессы фосфорилиро-вания. Симптомы острого отравления, описываемые ниже, являются, следовательно, результатом этого широко распространенного ингибирования ферментов. На амилазу слюны, однако, фториды не действуют даже при очень высоких концентрациях . [c.525]

Моделью для многих приборов на основе описанных в этой главе реакций может служить рассматриваемое ниже устройство, в котором используется оптическое волокно диаметром 3,3 мм [12] (см. также тл. 30). В этом приборе, измеряющем концентрацию пероксида водорода в буферном растворе, пероксидазу иммобилизуют в прозрачном полиакриламидном геле и вводят люминол как в гель, так и в раствор. С помощью фотоумножителя, помещенного на другом конце волокна длиной 61 см, можно детектировать концентрации до 10 М. Указывается, что в отличие от других ферментных электродов нет необходимости в том, чтобы продукт ферментативной реакции диффундировал к поверхности электрода. Таким образом, время отклика прибора очень мало-около 4 с. При этом, однако, возникает проблема, связанная с тем, что сигнал лимитируется массопереносом. Использование световода простой формы позволяет сделать конструкцию приборов удобной и работоспособной [4]. Так что эта идея заслуживает внимания. При реализации такого подхода основные проблемы, вероятно, связаны с иммобилизацией фермента. В случае иммуносенсоров, конечно, возникают трудности, обуславливаемые крайне низкой скоростью установления равновесия при связывании лиганда с антителом. Тем не менее благодаря высокой чувствительности детектирования света и независимости от процессов на электроде дальнейшие исследования в этой области представляются перспективными. [c.500]

В случае высокомолекулярных субстратов существенное уменьшение константы скорости бимолекулярных реакций определяется уменьшением коэффициентов диффузии. Для ферментативного окисления ферроцитохрома С перекисью водорода с помощью цитохрома С пероксидазы теория реакций, контролируемых диффузией, при использовании параметров 0 2 — Ю" см -с и= 5A удовлетворительно описывает экспериментальные данные (Ag n = 1,2-10 М" -с , /е,еор = 2-10 М-1.С-1) [29]. [c.270]

Ферменты, используемые в ИФА в качестве маркеров, должны отвечать ряду требований иметь высокую активность и стабильность в условиях анализа чувствительный и простой метод определения продуктов или субстратов ферментативной реакции сохранять активность и стабильность после конъюгирования с антителами быть доступным при высокой степени чистоты. Непременным условием является отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемых биологических жидкостях. Всем этим требованиям отвечают наиболее часто применяемые в ИФА пероксидаза и щелочная фосфатаза. [c.317]

Медиаторный механизм транспорта электрона достаточно широко используется для проведения электрохимических ферментативных реакций. В работе 45] описан электрохимический процесс с участием лактатдегидрогеназы, флавинмононуклео-тида и феназинметасульфата в качестве медиаторов в работе i[12] проанализирована электрохимическая ионизация водорода на угольных электродах, катализируемая гидрогеназой в работе 47] исследованы эффекты ускорения ионизации кислорода в системе пероксидаза — ионы металла — гидрохинон — пи-рографитовый электрод. [c.76]

Для современных энзимологов существование фермент-субстратных комплексов — почти аксиома. В настоящее время накопилось огромное множество кинетических и других данных, подтверждающих образование таких комплексов в ходе ферментативных реакций, причем многие из них очень трудно объяснить каким-либо иным образом. Наиболее убедительны с этой точки зрения многочисленные прямые наблюдения образования соединений фермента с субстратом. Первое из них — наблюдение осаждения папаина его субстратом фибрином [1] — относится к 1880 году последние известные нам работы такого рода — исследования кристаллического фермент-субстратного комплекса оксидазы О-ами-нокислот с помощью оптических методов и метода ЭПР [2—5]. Классическими примерами служат гемопротеиды— пероксидаза и каталаза [6, 7], для которых образование промежуточных комплексов было доказано с помощью прямых спектроскопических методов более 30 лет назад [8, 9]. Позднее прямые доказательства образования подобных комплексов были получены с помощью самых разнообразных методов при исследовании гидролитических ферментов [10—14], альдолаз [15, 16], ряда дегидрогеназ [17—21] и тиотрансферазы ро-данезы [22, 23]. [c.55]

Хорошо известно, что в водных буферных растворах в обычном для биологических объектов температурном интервале (0-ь40°С) энергия активации некоторых ферментов увеличивается при понижении температуры и при определенной температуре наблюдается излом в аррениусовской зависимости [637, 638]. Оказалось, что для ряда ферментативных реакций при низких температурах также наблюдаются отклонения скорости реакции от закона Аррениу-са [639]. На рис. 9.1 показана температурная зависимость константы скорости окисления гваякола перекисью водорода, катализируемого пероксидазой [625]. [c.239]

Химические реакции, однако, не всегда происходят пптсму, что молекула субстрата входит в замочную ск ала ру своего фермента и активируется. Для неко-ггрых ферментов, таких, как пепсин, это соединение двух молекул само по себе достаточно для превращения субстрата. Однако очень часто для этого необходимо еще третье вещество, небелковой природы. В каталазе, пероксидазе и других ферментах имеются такие вспомогательные вещества, более или менее прочно прикрепленные к их белковым молекулам. Эти вещества были названы простегическими группами. Однако для многих ферментов требуется, по-видимому, только присутствие таких вспомогательных веществ в растворе в виде так называемых коферментов. Эта область исследования ферментов наиболее активно разрабатывается и является предметом споров, и вообще весь вопрос о помощниках ферментов требует глубокого изучения. До сих пор нам твердо известно одно в больщей части ферментативных реакций наличия одного только белка недостаточно для биокатализа. Если в описанной выше системе спиртового брожения отсутствует кофермент I, то процесс останавливается. [c.177]

Согласно собственным исследованиям автора и анализу литературных источников, стало вполне очевидным, что изменения метаболизма, вызываемые вирусами, специфичны для растения-хозяина. Под влиянием вируса происходит как ингибирование, так и индуцирование синтеза новых изоэнзимов пероксидаз. Но так как фермент в клетках растений представлен большим набором изоэнзимов (от 3 до 42 молекулярных форм) с широким диапазоном ферментативной деятельности, в пределах pH от 3 до 14, то изучение этого фермента весьма сложно. Сведений о каталитической активности каждого из изоэнзимов пероксидазы в реакциях метаболизма разных растительных организмов весьма недостаточно. Тем более практически нет таких сведений об изменении каталитических свойств индивидуальных изопероксидаз. в вирозных растениях. Физикохимическая характеристика пероксидаз, выделенных из зараженных вирусами и контрольных растений табака, свидетельствует об определенных различиях между ними [Воронова и др., 1981]. Применение хроматографических методов исследований позволило выделить два белка с пероксидазной активностью и изучить некоторые каталитические свойства их в опыте и контроле [Андреева и др., 1979 Андреева, 1981]. Это дало возможность получить новую информацию об активности изопероксидаз вирозных растений. [c.5]

Некоторые оксидазы, широко распространенные в живых организмах, являются хромопротеидами, родственными гемоглобину, но отличающимися от последнего своими физиологическими функциями. Все они содержат в качестве простетической группы комплекс Я елеза с протопорфирином. К этой категории относятся каталаза и пероксидаза — два фермента, катализирующие реакции перекиси водорода, а также цитохром и дыхательный фермент Варбурга (цитохромоксидаза), играющие особенно важную роль в клеточных окислениях. Все эти ферменты были выделены в кристаллическом состоянии (два других — цитохромы а ж Ъ — были идентифицированы по их спектрам) (об их ферментативном действии см. главу Ферменты ). [c.454]

По окончании этой стадии полоску целиком погружают в проявитель. Иммунологически связанный конъюгат пероксидазы катализирует окисление 4-хлорнафтола пероксидом водорода, выделяющимся в реакции глюкозы с Ог под действием глюкозооксидазы. При этом образуется нерастворимый голубой продукт, прилипающий к полоске. Хотя пероксид водорода выделяется равномерно вдоль всей полоски, окрашенный продукт появляется только на тех участках, где локализован конъюгат пероксидазы с антигеном. Применение системы детектирования, основанной на сопряженных ферментативных реакциях, позволяет обходиться без сравнительно нестойких проявителей, содержащих пероксид водорода. Окраска формируется за 5 мин, при этом появляется цветная зона или ракета с остроконечным фронтом, высота которого зависит от концентрации антигена в образце (рис. 10-15). [c.151]

Таким образом, в реакциях оксидазного окисления, пероксидаза способна катализировать окисление органических соединений, среди которых могут быть и функционально активные вещества. Причем в каталитическом процессе участвует белковый компонент. Реакция сопровождается образованием продуктов свободнорадикального окисления которые приводят к образованию активных форм кислорода. При этом образующаяся перекись водорода взаимодействует с ферментом с образованием соединения I, которое инициирует пероксидазные реакции. По-видимому, в этом случае могут параллельно протекать как реакции оксидазного, так и пероксидазного окисления. Причем последние ускоряют окисление органических субстратов. Образование радикалов органических соединений может способствовать модификации функциональных групп белка, участвующих в катализе, что может приводить к инактивированию фермента, проявляемое в понижении скорости ферментативной реакции. Наличие данного процесса продемонстрировано в реакции оксидазного окисления диоксифумаровой кислоты [Березин и др., 19756]. Используя в качестве субстрата пероксидазы о-дианизидин, который окисляется только перекисью водорода и не окисляется кислородом. Показано, что в системе ДФК-ПО-О наблюдается окисление о-дианизидина, причем скорость его окисления возрастала с увеличением концентрации ДФК. Поэтому образование перекиси водорода в ходе оксидазных реакций пероксидазы является пусковым механизмом для последующего протекания пероксидазных реакций фермента. Данный механизм может быть использован организмами, находящимися в состоянии покоя или гибернации, поскольку активизация оксидазных процессов в биогенной системе может служить пусковым механизмом для покоящихся систем, обеспечивая их энергетические потребности при выходе из состояния покоя. [c.36]

Рис. 14. Линеаризация экспериментальных данных по кинетике пероксидазного окисления гидрохинона в условиях ингибирования ферментативной реакции его избытком. pH 6,0 0,1 М натрий-фосфатный буфер пероксидаза — 2 нМ Н О — 0,32мМ гидрохинон— 0,11—1,6мМ.

Таким образом, строфантин С и хлорпромазин при pH > 6,0 могут конкурировать за место связывания в активном центре фермента, при этом связывание ингибитора препятствует последующему связыванию субстрата, что и приводит к понижению скорости ферментативной реакции. Несколько иной тип ингибирования проявлял строфантин С в реакциях пероксидазного окисления трифтазина. При кислых значениях pH строфантин С связывался вблизи активного центра фермента, не влияя на связывание субстрата, что проявлялось в неконкурентном характере ингибирования (рис. 36, а). Депротонирование одной из функциональных групп активного центра пероксидазы с рК 6,0 резко ухудшало каталитическое превращение трифтазина, пони- [c.93]

Наличие обширной субстратсвязывающей области в активном центре пероксидазы создает условия для связывания сразу нескольким молекулам субстратов одинаковых или разных по строению, при возможности только одному из них участвовать в каталитическом процессе. Тогда как действие другого субстрата проявляется в регулировании (активировании или ингибировании) ферментативной реакции. При этом реализуется принцип один окисляется, а другой регулирует каталитический процесс. Причем разные по природе субстраты связываются в различных участках активного центра фермента или в области расположения регуляторного участка. [c.140]

Отметим, что для детекции антител разработаны также и нерадиоактивные (хромогенные) методы. Они основаны на свойствах пе-роксидазы из хрена и щелочной фосфатазы образовывать цветные нерастворимые продукты в процессе ферментативной реакции. Эти ферменты ковалентно связывают с вторичными антителами, которые реагируют со специфическими сайтами на первичных антителах После обработю фильтров такими комплексами в местах локализации искомых белков образуются суперкомплексы антигек — антите-ло антитело — фермент. Их положение определяют смочив фильтр в растворе проявляющего вещества (субстрата ферм нта). Например, для пероксидазы хрена хромогенным субстратом является 4-хлоро-1-нафтол, способствующий появлению на фильтрах пурпурных пятен. В качестве альтернативного метода вторичные антитела связывают с биотином, а пероксидазу хрена — с авидином. [c.286]

Рассмотренный выше подход к исследованию механизма ферментативной реакции при переменной концентрации субстрата по кинетике образования и расходования промежуточного соединения был использован Б. Чансом при изучении механизма катализа окислительными ферментами каталазой и пероксидазой. Спектры поглошения в видимой области комплексов гемсодер-жаших ферментов каталазы и пероксидазы с перекисью водорода и органическими перекисями сушественно отличаются от спектров поглошения исходных ферментов. Это позволило Чансу провести непосредственное кинетическое изучение промежуточных соединений методами ускоренной и остановленной струи с использованием высокочувствительной спектрофо- [c.170]

Ацилферменты в механизме катаЛйза сериновыми протеазами (139). Определение кинетических параметров (147). Структура и реакционная способность ацилферментных производных а-химотрипсина (150). Молекулярная модель катализа а-химотрипсином (158). Предстационарная кинетика многостадийной ферментативной реакции (159). Экспериментальные методы исследования нестационарной кинетики (162). Нестационарная кинетика ферментативных реакций при переменной концентрации субстрата. Кинетические закономерности реакции с участием одного промежуточного соединения (165). Каталаза и пероксидаза (170). [c.710]

Ферменты, выделяемые грибами, — мощный фактор биоповреждений металлоконструкций. К таким ферментам относят оксидоредуктазы (каталаза, пероксидаза, полифенолоксидаза) и эстеразы (фосфаталазы, липазы). Продукты преимущественно определенного вида ферментов разрушают ряд материалов и покрытий продуценты липазы — резины, битуМы продуценты дегидрогеназы, каталазы, пероксидазы — строительные материалы фосфатазы — фенопласты. Разрушение многих полимерных материалов происходит в результате комплекса реакций окислительно-восстановительных процессов, декарбоксилирования, этерификации, гидролиза и др. Алканы, входящие в состав нефтепродуктов, разрушаются в результате термального окисления алкены — гидратацией двойной связи с образованием эпокси-групп этанолов и диолов. Ферментативная активность некоторых грибов приведена в табл. 10.8. [c.316]

Биологическая функция каталазы состоит в освобождении клетки от избытка перекиси водорода, образующейся при многих окислительно-восстановительных процессах, как, например, при действии ксантиноксидазы, уриказы, оксидазы -а-аминокислот, диаминооксидазы, и при ряде других ферментативных процессов. Образующаяся перекись водорода или расходуется в процессах, катализируемых пероксидазой, или же разрушается каталазой, причем образующийся кислород снова может быть использован в окислительных реакциях клетки. Таким образом, каталаза является важным элементом общей окислительно-вос-становительной системы клетки. [c.66]

Влияние pH обнаружено для каталазы, пероксидазы хрена и хлоро-пероксидазы, причем оно распространяется как на константы равновесия связывания анионов, так и на константы скорости окис-, лительно-восстановительпых реакций, протекающих при участии анионов. Можно предположить, что природе пришлось развить это свойство для какой-то специальной цели и что оно каким-то способом участвует в обеспечении ферментативной активности. Поэтому целесообразно рассмотреть такого рода эффекты более подробно. [c.206]

Смотреть страницы где упоминается термин Пероксидаза ферментативных реакция: [c.800] [c.410] [c.184] [c.329] [c.294] [c.13] [c.61] [c.70] [c.73] [c.73] [c.85] [c.361] [c.403] [c.413] [c.63] [c.226] [c.58] [c.416] [c.302] [c.49] [c.514]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология