Определение молекулярных масс по коэффициентам седиментации

Седиментация (в большинстве случаев в ультрацентрифуге) используется для определения мольной массы молекулярных коллоидов (макромолекул). В этих же целях применяют измерения осмотического давления, вязкости, коэффициента диффузии. [c.499]

При определении молекулярной массы по методу седиментационного равновесия знание коэффициента диффузии не является необходимым. В этом случае используют более низкое число оборотов. По сравнению с предыдущим методом, для которого необходимо гравитационное поле до 400 ООО g, здесь достаточно центробежной силы, в 10 — 15 тыс. раз превосходящей земное притяжение. Через несколько часов или через несколько суток процесс седиментации и обратной диффузии достигает состояния равновесия, при котором перемещение частиц отсутствует. Измерив градиент концентрации белка от мениска до дна ячейки, можно вычислить его молекулярную массу. Медленное установление равновесия — недостаток метода. Этого можно избежать при проведении определения по Арчибальду. В этом низкоскоростном методе для расчетов можно использовать градиент концентрации, образующийся в измерительной ячейке у мениска жидкости (до отделения белковой зоны). Метод нулевой концентрации в мениске, предложенный в 1964 г., делает возможным достижение седиментационного равновесия при высокой скорости ротора (высокоскоростной метод), в этом случае белковая зона уже отделена от мениска. Это дает возможность сократить время эксперимента до 2 — 4 ч. [c.361]

Существует несколько физических методов абсолютного измерения молекулярных масс, в первую очередь основанных на использовании седиментации или рэлеевского рассеяния света. Они требуют существенно большего количества индивидуального биополимера, чем описанные химические и биохимические методы, проводятся путем прецизионных измерений на дорогостоящем оборудовании и применительно к задаче измерения молекулярных масс белков и нуклеиновых кислот постепенно утрачивают свое значение. Седиментационные методы основаны на использовании уравнений (7.2) или (7.3). В первом случае измерению подлежат константа седиментации биополимера и коэффициент диффузии. Во втором случае нужно достичь состояния седиментационного равновесия и измерить распределение концентрации исследуемого биополимера вдоль центрифужной ячейки, т.е. концентрацию биополимера на нескольких разных расстояниях г от оси ротора. Оба метода требуют определения парциального удельного объема, или, что то же самое, плавучей плотности биополимера в условиях, используемых для седиментации. [c.267]

III. 2.3. Определение молекулярных масс по коэффициентам седиментации [c.185]

Очень компактное и вместе с тем полное руководство по применению ультрацентрифугирования в современных биологических исследованиях. После краткого исторического обзора и описания наиболее распространенных ультрацентрифуг автор последовательно рассматривает принципы и возможности оптических систем, используемых в аналитических центрифугах, способы измерения коэффициентов седиментации и диффузии, важнейшие методы определения молекулярной массы, основы количественного анализа смесей, а также методы препаративного ультрацентрифугирования. [c.4]

Коэффициент седиментации 5 и коэффициент диффузии О входят (в виде отношения, / >) в уравнение Сведберга (1.11) — основное уравнение для определения молекулярной массы. Тут следует иметь в виду следующее для вычисления молекулярной массы по уравнению (1.11) необходимо определять 5 и О в одинаковых растворителях и при одинаковой температуре, экстраполируя полученные значения к бесконечному разбавлению. Если молекулярный вес определяют равновесными методами или методом Арчибальда, отношение //) в явном виде в соответствующие уравнения не входит. Что касается неравновесного опыта, то, когда плотность растворенного вещества превышает плотность растворителя, происходит два противоположных процесса седиментация вещества, с одной стороны, и диффузия — с другой. Если в результате седиментации молекулы растворенного вещества устремляются ко дну ячейки, то в результате диффузии происходит обратное явление молекулы вещества стремятся равномерно распределиться по всему объему ячейки. Седиментация и диффузия, таким образом, действуют в противоположных направлениях, и какое из этих двух движений преобладает — зависит от величины ускорения центробежной силы. [c.58]

Уравнение Хаувинка — Марка применяется для определения молекулярной (вискозиметрической) массы полимеров. Коэффициенту а я К в этом случае должны быть предварительно установлены путем исследования полимеров этого же полимергомологического ряда с известной молекулярной массой, определенной прямыми, независимыми от вискозиметрических, методами (светорассеяние, осмометрия, седиментация, диффузия). [c.16]

Принципиально возможно определение коэффициентов седиментации и, следовательно, приблизительных молекулярных масс даже не вполне индивидуальных белков, если имеется подходящий метод для измерения относительных концентраций белков, например путем измерения их ферментативной активности. Изучаемый образец осторожно наносится на раствор сахарозы с линейным градиентом концентрации и подвергается высокоскоростному центрифугированию в роторе с откидывающимися пробирками (в ба-кет-роторе). Обычно в качестве стандарта в раствор добавляется белок с известным коэффициентом седиментации s. Вещества с различными седиментационными свойствами отделяются в градиенте плотности друг от друга, образуя полосы. По окончании центрифугирования в нижней части центрифужной пробирки проделывают небольшое отверстие, фракции сливают и анализируют. Если фракции отбирают через различные промежутки времени центрифугирования, то временная зависимость расстояния от мениска до зоны белка, обладающего активностью, должна быть линейной. Для данного времени центрифугирования соблюдается следующая [c.130]

Зная коэффициент диффузии и коэффициент седиментации, можно рассчитать молекулярные массы по уравнению седиментации — диффузии (1.11). Этот метод, однако, не получил широкого распространения из-за некоторых принципиальных недостатков. Подробно данный вопрос осветили Крис и Пейн [4]. Когда для определения степени гомогенности препарата используется скоростная седиментация, обычно одновременно определяют и коэффициент седиментации. С помощью последнего можно получить ориентировочные данные о величине молекул, что дает возможность планировать соответствующие эксперименты для определения молекулярной массы. Биохимикам часто приходится ставить препаративные опыты, и в этом случае знание коэффициентов седиментации макромолекул и сопровождающих их компонентов значительно облегчает выбор условий для правильной постановки таких опытов. [c.63]

Исходя из общих принципов термодинамики необратимых процессов, можно вывести уравнения, по форме очень близкие к полученным выше. В эти уравнения входят такие величины, как 5, О, коэффициенты активности и т. п. Чтобы приложить эти уравнения, скажем, к определению молекулярной массы белка в солевом растворе, необходимо сделать некоторые допущения. Достоинство термодинамического вывода состоит в том, что он позволил выяснить целесообразность этих допущений. К примеру, оказывается, что считавшееся нами раньше необходимым допущение о равенстве к оэффициентов трения в случае седиментации и диффузии (при выводе уравнения Сведберга) является в действительности излишним. [c.90]

Оценка значения V важна при определении молекулярной массы и коэффициента седиментации. Более того, требуется высокая точность измерения у, так как диапазон значений V для биологических макромолекул (0,6—0,75) приводит к тому, что ошибка в 1% при измерении V дает ошибку около 3% в значениях М или 5 20,в- В действительности измерение V часто бывает лимитирующим фактором при определении молекулярной массы. Существует три основных метода определения д суммирование и мономерных остатков макромолекулы, использование методов измерения плотности и параллельные измерения седиментационного равновесия в изотопно меченных растворителях. [c.350]

Метод скоростной седиментации позволяет определять отношение молекулярной массы и коэффициента поступательного трения (М//), который, в свою очередь, связан с размером макромолекул. На величину этого отношения определенное влияние оказывает также полидисперсность полимерных образцов. [c.231]

Для установления числа поперечных связей в молекуле необходимо знать отношение характеристических вязкостей данной молекулы и линейной молекулы такой же молекулярной массы. Чтобы получить это отношение, было выведено [1122, 1123] уравнение, связывающее характеристическую вязкость и коэффициент седиментации. Этот метод можно использовать для определения числа поперечных связей в различных фракциях бутадиен-стирольного каучука. Зная массу каждой фракции и содержание в ней поперечных связей, можно рассчитать общее число поперечных связей в нефракционированном каучуке. [c.263]

В табл. 11.1 приведены некоторые определенные опытным путем типичные значения 20 ш- можно сделать с этими величинами, зависит от ответа на вопрос что еще известно о данной системе Если известна молекулярная масса, то, определив 2о дем коэффициент трения/, который можно сравнить с/ , , т.е. с коэффициентом, который имела бы сферическая частица той же массы при отсутствии гидратации. Можно проанализировать далее отношение /// с тем, чтобы наложить ограничения на форму и степень гидратации частицы в точности так, как это было описано ранее для коэффициентов диффузии. В табл. 11.1 сравниваются коэффициенты трения, определенные с помощью диффузии и с помощью седиментации. В большинстве случаев эти величины довольно хорошо согласуются. Если же известны и и то молекулярную массу можно вычислить по формуле (11.33). Тогда, пользуясь любым из двух уравнений (11.32), получают коэффициент трения. Но, поскольку при седиментации и диффузии одинаково учитывается комбинированная зависимость от конформации и гидратации, знание обоих коэффициентов не проясняет вопроса о том, какая часть избыточного трения (сверх происходит за счет гидратации. В табл. 11.2 сопоставляются молекулярные массы, при определении которых пользовались уравнением Сведберга, с величинами, полученными [c.238]

Классическим методом определения размеров ДНК является седиментация в центробежном поле. Скорость седиментации молекул пропорциональна силе поля со г и определяется уравнением йг1<а=8и) г, где со — угловая скорость и г — расстояние до центра вращения. Коэффициент седиментации 5 связан с молекулярной массой ДНК эмпирическим уравнением 5 = 0,0882-10 Оп- [c.228]

Трение влияние формы 299 Молекулярная масса 300 Метод точного измерения коэффициента седиментации 301 Примеры использования скоростной седиментации 302 Зональное центрифугирование в предварительно подготовлен ном градиенте плотности 306 Определение коэффициента седиментации с помощью зонального центрифугирования в предварительно приготовленном градиенте плотности ЗП [c.578]

Из предыдущего рассмотрения ясно, что точного уравнения, связывающего электрофоретическую подвижность с молекулярными параметрами, не имеется. В пределах приближения, вытекающего из игнорирования всех членов, кроме первого, в правой части феноменологического уравнения [уравнение (24-4)], и не отличающегося от того, которое было сделано при анализе данных по седиментации и диффузии высокомолекулярных электролитов в солевых растворах, могут быть сделаны два определенных утверждения. а) Подвижность и всегда прямопропорциональна заряду 2-макроиона. б) Подвижность всегда обратно пропорциональна коэффициенту трения, как показывают уравнения (24-6), (24-7) и (24-8), которые все применимы только к сферическим ионам (поскольку в знаменателе стоит выражение бяг] ). Это делает электрофорез могучим средством полуколичественного анализа, которое имеет огромное значение в химии белков. Многие приложения такого подхода являются по своей природе аналитическими и выпадают из плана настоящей книги, но другие, дающие полезную информацию относительно молекулярных свойств, будут здесь кратко описаны. Обсуждение ограничено данными по растворимым белкам, потому что основная масса работ в этой области выполнена на белках. (Пример электрофореза синтетического полиэлектролита будет приведен в разделе 27.) [c.479]

Во-вторых, с помощью физико-химических методов, применимых. к белковым растворам, можно установить молекулярный вес. Он может быть определен несколькими различными приемами, при условии, если материал монодисперсен. К таким приемам относятся методы измерения осмотического давления, светорассеяния, седиментационного равновесия и измерения скорости седиментации и диффузии. Все эти приемы основаны на различных принципах и часто дают не вполне совпадающие результаты. Это объясняется тем, что получаемые данные зависят не только от размеров и массы, но и от. электрического заряда, формы и степени гидратации белковых молекул. При измерении скорости движения частиц (например, скорости диффузии или скорости седиментации) хорошие результаты получаются только для тех молекул, форма которых близка к шарообразной, ибо они ведут себя в соответствии с изученными закономерностями. Отклонение от сферической формы (фибриллярные белки) и гидратация молекул приводят к различным ошибкам, так как движение молекул замедляется в результате увеличения коэффициента трения или эффективного размера частиц. [c.128]

Вследствие гидродинамического взаимодействия макромолекул коэффициент седиментации 5 может изменяться с изменением концентрации исследуемого раствора. Поэтому при определении молекулярных масс коэффициент седиментации экстраполируют к -бесконечному разбавлению и получают константу седиментацип 5 , характеризующую индивидуальную молекулу. В литературе [c.363]

Для определения молекулярной массы седиментацией в ультрацентрифуге служит водный раствор смеси сульфита Na и NaOH с пиридином. Сильная абсорбция растворов ВВВ в области 4350— 5460 A делает возможным их исследование только в случае применения лазерного источника (изучение растворов светорассеянием) с длиной волны 6328 А. Коэффициент экстинкции растворов ВВВ в метансульфокислоте при этой длине волны равен [c.1036]

Определение этого фактора затрудняется тем обстоятельством, что значение коэффициента активности у не всегда известно. Однако при бесконечном разбавлении значение этого фактора становится равным единице. Следует помнить, что в уравнениях (VI. 1), (VI. 2) и (VI. 3) можно использовать только такие данные, которые относятся к бесконечному разбавлению или по крайней мере к таким малым концентрациям, при которых термодинамический фактор очень мало отличается от единицы. Наилучшие результаты получаются для компактных, слабо заряженных молекул некоторые же молекулы вызывают особые затруднения — это сильно асимметричные или сильно заряженные молекулы, например нуклеиновые кислоты. Что касается электростатических эффектов, то их можно устранить, используя растворы, содержащие соли, например 0,1 Ai K I. Кроме того, можно уменьшить заряд белковой молекулы. Для этого подбирают такое значение pH раствора, которое близко к изоэлектрической точке белка. Фрикционные свойства макромолекул при седиментации обычно не зависят от скорости вращения ротора, так как даже при больших скоростях не наблюдается предпочтительной ориентации макромолекул. Поэтому можно использовать различные скорости вращения, так как это дает полезную информацию. Так, при анализе данных, относящихся к области мениска, как, например, в методе Арчибальда, путем изменения скорости и времени вращения можно обнаружить в исследуемом образце легкий компонент. Особенную трудность представляет определение молекулярной массы ДНК- Один из подходов к определению величины М для ДНК — измерение характеристической вязкости. К этой теме мы вернемся в гл. VII. Более подробные сведения о проблеме определения молекулярной массы ДНК можно найти в работе Эйтена и Коэна [4]. [c.99]

Как уже указывалось, такие гидродинамические величины, как коэффициент седиментации о, коэффициент диффузии характеристическая вязкость [т)], в основном опреде ляются молекулярной массой М и размерами макромолекулы В связи с этим естественно предположить, что определенное сочетание этих величин может быть инвариантно по отношению к конкретному химическому строению цепи, ее взаимодействию с растворителем. Гидродинамический инвариант Лгд равен [46] [c.182]

К другим типам усреднения приводят методы исследования гидродинамических свойств растворов асфальтенов и соответствующие им срёдние молекулярные массы навываются среднегидродинамическими М г). Их определяют по вязкости растворов, константе седиментации или коэффициенту диффузии. Средние молекулярные массы, полученные различными методами, различаются между собой в тем большей степени, чем шире молекулярно-массовое распределение полимера По относительному значению они располагаются в ряд М < Мш < Мг. Для различных асфальтенов установлена- высокая полидисперсность [306]- Так, для ряда асфальтенов, выделенных из битумов деасфальтизации, значение Мя (определенное криоскопически в бензоле), равно 2200, а Mw, определенная по скорости диффузии в бензольном растворе, составляет 8540. Отношение M lMn — 3,5 указывает на высокую степень полидисперсности асфальтенов. [c.152]

Если молекулы не имеют сферической формы, то коэффициент седиментации сам по себе нельзя использовать для определения молекулярного веса оседающего вещества. Однако при измерении и коэффициента седиментации и коэффициента диффузии молекулярный вес вещества можно вычислить, не делая никаких предположений о форме молекул. Уравнение, на котором основывается это вычисление, может быть выведено путем приравнивания центробежной силы, действующей на частицу, силе трения (где / — коэффициент трения молекулы, а б.г1й1 — скорость седиментации). Центробежная сила, действующая на частицу с массой т и парциальным удельным объемом V, суспендированную в среде с плотностью р, равна [c.614]

Все выделенные из древесины препараты целлюлозы характеризуют выходом и примесями эпутствующих полисахаридов, а также изменениями, вызванными процедурой выделения. Одним из важнейших показателей является молекулярная масса, или СП. Молекулярную массу целлюлозы, как и других полимеров, определяют абсолютными и косвенными методами. Из абсолютных методов используют определение осмотического давления (в осмометре) определение констант седиментации (в ультрацентрифуге) и коэффициентов диффузии (в диффузометре) определение интенсивности светорассеяния (в фотометре светорассеяния). [c.30]

Величина S, экстраполированная к нулевой концентрации, называется константой седиментации и является характеристикой макромолекулы в растворе. Она представляет собой скорость оседания, отнесенную к единице силового поля, и колеблется от 2 (Л1 = 10 000) до 200 (/М = 10 ООО ООО). Зависимость S от молекулярной массы может быть представлена в виде уравнения S= Ks, где / s — константа, 6 имеет тот же смысл, что в аналогичном уравнении определения М по коэффициенту диффузии. Описанный седиментационный метод дает среднеседиментационную молекулярную массу [c.542]

Следует отметить, что для изучения эффекта Максвелла в концентрированной серной кислоте были разработаны специальные тефлоновые приборы, в которых исключены все металлические детали [50]. Сравнительное изучение двойного лучепреломления Дга и углом ориентации поли-п-бензамида в серной кислоте и в диметилацетамиде доказало, что только в концентрированной серной кислоте этот полимер, как и многие другие (полимеры 1,2, 4,5 в табл. 6) дает молекулярно дисперсные растворы. Бььца доказана стабильность сернокислотных растворов во времени [50]. Исследование растворов в серной кислоте позволило по углам ориентации в потоке впервые получить правильный порядок молекулярных масс поли-л-бензамида [50], поскольку основные стандартные методы определения М (такие, как, например, седиментация) к этим полимерам были неприменимы. Методика измерения коэффициентов поступательной диффузии в серной кислоте была разработана позже [56]. [c.25]

Стоимость современной аналитической ультрацентрифуги по мере ее усовершенствования все время повышается. Возрастают также и расходы на ее содержание. Одна только сканирующая ультрафиолетовая двухлучевая система (гл. III), безусловно очень нужная, сильно повышает стоимость прибора. Вместе с тем в обычной биохимической лаборатории большая часть экспери.мен-тов по седиментации ведется лишь с целью определения степени гомогенности препаратов по молекулярной массе с использованием обычной шлирен-системы. Получаемые при этом данные о коэффициентах седиментации и [c.36]

Метод седиментации — диффузии не получил широкого распространения, так как его применение требует специальных экспериментов для определения коэффициента диффузии. Одно время казалось, что применение этого метода целесообразно в тех случаях, когда трудно очистить препарат настолько, насколько это необходимо для равновесного ультрацентрифугирования. Однако при работе с недостаточно чистым препаратом возникает неопределенность— не ясно, какого типа средняя молекулярная масса измеряется методом седиментации — диффузии. Юлландер [5] показал, что этот метод дает значение молекулярной массы, промежуточное между Мп и Ми, и обычно более близкое к Л1( . Относительное положение значения этой молекулярной массы на соответствующем графике зависит от характера молекулярно-весового распределения. Описанный метод по количеству анализируемого вещества не столь экономичен, как равновесные методы. Его, однако, часто применяют для дополнительной проверки значений молекулярной массы, полученных другими способами. [c.106]

На левой ординате отложены средневесовые значения молекулярных масс, определенные методом седиментационного равновесия, на правой ординате— коэффициенты седиментации в единицах Сведберга. Масштаб справа выбран так. что коэффициент седиментации 4, 6, 5 отвечает молекулярной массе 64 ООО. [c.224]

Молекулярная масса углевод-белковых полимеров является величиной усредненной, учитывающей полидисперсность полимеров. Уже на стадии выделения, очистки и определения гомогенности этих биополимеров можно приблизительно оценить их свойства и молекулярную массу. Предварительное определение вязкости веществ и содержания в них сиаловых кислот позволяет выбрать те или иные пути дальнейшего исследования. Молекулярная масса углевод-белковых полимеров может быть рассчитана на основании гидродинамических данных, коэффициентов седиментации, диффузии, характеристической вязкости. Молекулярная масса и форма молекул могут быть вычислены по данным све- [c.75]

Уникальная структурная черта всех рибосом заключается в том, что они построены из двух неравных субчастиц, или субъединиц. Для характеристики рибосом и их субъединиц используют их свойство, как и всяких частиц и молекул, осаждаться с постоянной скоростью в определенном буферном растворе под действием центробежной силы, возникающей при центрифугировании. Седиментационные свойства рибосом характеризуются коэффициентом, или константой, седиментации, выраженным в единицах седиментации Сверберга (S). С помощью центрифугирования удалось установить, что константа седиментации рибосом варьирует от 70 до 80S. Рибосомы бактерий и синезеленых водорослей при молекулярной массе (2,8...3) 16 имеют коэффициент седиментации около 70S, а рибосомы л<ивотиых, высших растений и водорослей при молекулярной массе (4...5) 16 —около 80S. [c.41]

Уравнением (11.33) нельзя пользоваться так часто, как хотелось бы, поскольку диффузионные измерения представляют определенные трудности. Как мы покажем, возможна комбинашш седиментащюнных данных с результатами других гидродинамических измерений. Нередко бывает так, что коэффициент седиментации представляет собой единственную доступную информацию о гидродинамике частицы с неизвестной молекулярной массой, поскольку по сравнению с другими методами седиментациониые опыты либо могут быть выполнены быстрее, либо требуют меньшего количества материала. Когда применяют чувствительный метод фотоэлектрического сканирования, для определения бывает достаточно менее 0,1 мг белка в случае нуклеиновой кислоты это количество уменьшается еще на порядок. Измерения занимают не более нескольких часов, за это время граница успевает сместиться на расстояние порядка сантиметра такое расстояние можно измерить очень точно. [c.239]

На практике коэффициенты седиментации можно определить достаточно точно. Определение же коэффициентов диффузии гораздо более трудоемко. Поэтому метод седиментационного равновесия, который не требует определения коэффициента диффузии, намного удобнее и более широко используется для установления молекулярных масс белков. В этом методе ультрацеитрифугирование продолжают до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное распределение изучаемого белка по всей длине ячейки. При равновесии не происходит видимого перемещения белка в ячейке, поскольку его движение ко дну ячейки под действием центробежной силы полностью уравновешивается движением вверх, обусловленным диффузией. Такое равновесное распределение характерно для каждого белка и зависит от его молекулярной массы. После дости- [c.129]

Элонгация бносинтеза ДНК складывается по меньшей мере из двух процессов репликации з астков материнских цепей ДНК и соединения друг с другом синтезированных при репликации фрагментов новообразуемых цепей ДНК. Первый осуществляется при посредстве ДНК-полимеразной реакции (см. рис. 83), идущей со скоростью (в н. о./с) в среднем около 1000 у бактерий, 100—у животных и 10—у растений. Своеобразие его состоит в том, что репликация идет не непрерывно, а фрагментарно за один раз у прокариот синтезируется полидезоксирибонуклеотид с коэффициентом седиментации 8— 10S, т.е. молекулярной массой в несколько сотен тысяч дальтон (примерно из 1000 н. о.). У эукариот фрагменты Оказаки короче, около 200 н. о., что сопоставимо с длиной нуклеосомной ДНК, в чем, по-видимому, есть определенный [c.253]

В ГЛ. 11 говорилось, что молекулярную массу (М) можно опреде- 1ить по результатам измерения коэффициента седиментации (з) и коэффициента трения (/). Прямое определение / представляет трудную задачу к счастью, эти сложности можно обойти с помощью измерения коэффициента диффузии О, [c.355]