Пептиды, масс-спектр

Для больших пептидов Овчинников и Кирюшкин [132] рекомендовали применение комбинированного хромато-масс-спектрометрического метода идентификации дипептидов и обработку результатов анализа иа ЭВМ при использовании картотеки масс-спектров, содержащей данные для 400 возможных дипептидов. [c.373]

Как показано многочисленными исследованиями, убедительную идентификацию производных пептидов можно провести с помощью масс-спектрометрии [34, 85, 123]. Комбинация этих двух методов может значительно облегчить анализ последовательности пептидов — к тому же для обоих методов требуются очень малые количества вещества. Газовая хроматография пептидов изучалась только в двух лабораториях, в которых были предложены различные методики получения их производных. Для последующей идентификации крайне важно, чтобы структуру исходных соединений можно было узнавать по их производным. Хотя детальное рассмотрение масс-спектрометрии выходит за рамки рассматриваемого ниже процесса ГХ пептидов, многие операции, которые будут описаны, должны рассматриваться с учетом возможного использования масс-спектрометрического метода. Соединение капиллярной или набивной колонки непосредственно с масс-спектрометром дает возможность измерять полный масс-спектр каждого пика и, таким образом, с помощью этого способа получать необходимую информацию. [c.339]

Аминокислотный тип фрагментации, конечно, не является единственным путем распада молекулярных ионов пептидов. Боковые цепи каждого аминокислотного остатка вносят свои специфические особенности в общую картину масс-спектра. Ионы фрагментов, образующихся в результате специфического распада боковых цепей, дают дополнительную информацию о структуре пептидов. [c.72]

В книге рассмотрены особенности фрагментации под электронным ударом некоторых классов органических соединений с указанием диагностических признаков, позволяющих установить строение по масс-спектрам. Особо отмечены перегруппировочные процессы, осложняющие классификацию, систематизацию и обработку масс-спектров на электронно-вычислительных машинах. Высокую практическую ценность представляет разбор нескольких примеров установления структуры, включающих сложные органические, металлоорганические и природные соединения (пептиды). [c.8]

Температура ионного источника может оказывать и иное заметное влияние на масс-спектр — не за счет осуществляющихся химических превращений. При попадании в ионизационную камеру молекулы не обязательно ионизируются немедленно благодаря низкому давлению паров (большая средняя длина свободного пробега) молекулы до ионизации могут многократно сталкиваться со стенками камеры. При каждом таком столкновении со стенкой, даже если и не наблюдается химических превращений, может происходить перераспределение тепловой энергии. Ионизационные камеры источников с ионизацией электронным ударом обычно имеют температуру от 150 до 250° С, так что до ионизации молекула может получить довольно много тепловой энергии, которую следует учитывать наряду с энергией, сообщаемой молекуле при ионизации. Таким образом, молекулярный нон обладает избытком энергии, полученной и от горячего источника, и от ионизирующих электронов. Экспериментально найдено, что эти термические эффекты почти не обнаруживаются по масс-спектрам ароматических соединений, имеющих достаточно устойчивую структуру, однако по масс-снектрам алифатических соединений часто наблюдается резкое усиление степени фрагментации под влиянием температуры. На рис, 4.8 приведены для сравнения частичные масс-спектры пептида при различных температурах ионного источника нетрудно заметить, что интенсивность пика молекулярного иона резко снижается при [c.93]

В случае простых пептидов обычно не возникает необходимости в определении состава фрагментов, если не требуется подтверждение аминокислотной последовательности. Более крупные пептиды в результате конкурентной фрагментации боковой цепи часто дают сложные масс-спектры. Поэтому в таких случаях необходимо определение элементного состава всех ионов в спектре путем точного измерения масс (см. разд. 5.2). Из элементного состава фрагментов аминокислотная последовательность устанавливается, как указано выше. С целью облегчения анализа рассматриваемых фрагментов разработаны программы для ЭВМ. [c.123]

Рис. 4.31. Частичный масс-спектр пептида Н. Точные значения масс ионов приведены в табл. 4,8.

Частичные результаты измерения точного значения масс ионов в масс-спектре пептида (Н), полученные с помощью системы масс-спектрометр — ЭВМ [c.176]

Это позволило определить строение аминокислоты, из которой получен данный метилтиогидантоин. Новые сведения о порядке чередования аминокислотных остатков в коротких пептидах были получены па основанни исследоваиия масс-спектров этиловых эфиров ацетилпептидов, аминоспиртов и диаминоспиртов [208, 209]. В работе Н. К. Кочеткова и сотрудников масс-спектрометрический метод использовался для определения размера цикла в метиловых эфирах моносахаридов [210], установления конфигураций гликозидной связи в метилглюкозидах [211] и выяснения места свободного гидроксила в частично метилированных моносахаридах [212, 213]. [c.124]

Илентификация в масс-спектре пиков, соответствующих фрагментам А ...Ап или а ...Оп, дает информацию о строении пептида. [c.252]

Мол. ион пептида распадается в результате разрыва связей СН—СО, СО—NH, КН—СН и СН—К с образованием осколочных ионов соотв. А и Х , В и У , С и 2 , 8 и К (я-номер аминокислотного остатка в пептидной цепи), к-рые далее распадаются таким же образом. Общее кол-во пиков ионов в таком спектре может достигать неск. сотен. Кол-во фрагментов определяется строением исследуемой молекулы, запасом внутр. энергии мол. и осколочных ионов и промежутком времени между образованием иона и его детектированием. Поэтому при интерпретации масс-спектров необходимо учитывать как условия измерений (энергию ионизирующих электронов, ускоряющее напряжение, давление паров в ионном источнике, т-ру ионизац. камеры), так и конструктивные особенности прибора. При макс. стандартизации условий измерений удается получать достаточно воспроизводимые масс-спектры. Сравнение масс-спектра исследуемой системы со спектром, имеющимся в каталоге,-наиб, быстрый и простой способ структурного анализа, идентификации в-в при определении загрязнения окружающей среды, контроле продуктов питания человека и животных, изучении процессов метаболизма лек. препаратов, в криминалистике и т.д. Однако идентификация лишь на основании масс-спектра не может быть однозначной, напр, не Все изомерные в-ва образуют различающиеся масс-спектры. [c.662]

При бомбардировке быстрыми атомами (ББА) изучаемое вещество растворяют в подходящей нелетучей матрице, например в глицерине. Раствор помещают в виде тонкой пленки на металлическую подложку специального штока. Образец переносят в ионный источник и после вакуумирования облучают потоком атомов с энергиями около 8кэВ (например, атомами Аг или Хе). Для бомбардировки используют также высокоэнергетические ионы цезия. В качестве примера на рис. 9.4-6, а приведен масс-спектр пептида Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu, полученный при ионизации быстрыми атомами. [c.271]

Рис. 9.4-6. Методы мягкой ионизации, а — масс-спектр пептида Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu, полученный при ионизации методом ББА 5 — масс-спектр цитохрома лошади (1пмоль), полученный методом MALDI, в качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту в — масс-спектр цитохрома лошади (1 пмоль/мкл) в 50% водно-метанольном растворе (-(-1% уксусной кислоты), полученный методом электрораспыления в спектре присутствуют многозарядные ионы ( ионный конверт ).

Незащищенные олигопептиды, обладая низкой летучестью и термической лабильностью, практически не могут быть прюанализированы теми масс-спектрометрическими методами, которые включают перевод образца в парообразное состояние перед ионизацией. Для повышения летучести с целью исследования методом ЭУ эти олигопептиды переводят в алкиловые эфиры N-aцилпpoизвoдныx. Масс-спектры последних позволяют установить аминокислотную последовательность в олигопептидах на основе анализа ионов двух основных направлений их фрагментации. Главным направлением распада замещенных пептидов является "аминокислотный" тип фрагментации, обусловленный разрывами амидной связи с фиксацией заряда на карбонилсодержащих остатках. Образующиеся ионы далее теряют СО [c.166]

Пептиды недостаточно летучи, чтобы их можно было изучать епосредственно с помощью масс-спектрометрии электронного удара. Первые попытки применения масс-спектрометрии для определения последовательности включали предварительное ацилирование аминогрупп и этерификацию карбоксильных групп. Масс-спектры таких производных показали, что расщепление происходит с обеих сторон карбонильных групп. Расщепление связи С—N приводит к ионам ацилия —ЫНСНДС=0+, в то время как расщепление связи С—С дает альдиминиевые ионы —+NH= HR. Это основная тенденция кроме того, происходит дополнительная фрагментация боковых групп некоторых аминокислот, включая валин, лейцин, аспарагин, серин, треонин и цистеин. [c.278]

Ситуация существенно изменилась после того, как стали метилировать Л -ацетилированные пептиды. Такая обработка не только увеличивает летучесть образцов, но и значительно упрощает масс-спектр, так как в нем обычно преобладают ионы ацилия. Из нескольких методов полного метилирования, как правило, выбирают смесь метилиодида, гидрида натрия и диметилсульфоксида 128, 29]. При малом времени реакции (1—3 мин) и небольщом избытке метилиодида достигается метилирование амидного азота как в пептидной цепи, так и в боковых группах аспарагиновых и глутаминовых остатков, при минимальном образовании ониевых производных атомов азота (кватернизация) и серы в боковых группах гистидина, аргинина, метионина и цистеина. Образование ониевых производных понижает летучесть. [c.278]

Возможно идентифицировать и смеси коротких пептидов, получаемых после обработки белков ферментами, частичного разделения с помощью гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Сопоставление масс-спектров, полученных при различных температурах источника, а также использование полного метилирования и дейтерометилирования, обычно позволяют правильно идентифицировать пики исходных пептидов. [c.278]

В предыдущих главах рассматривались основные спектроскопические методы выяснения структуры органических соеди-неиений, базирующиеся на поглощении электромагнитного излучения. Начиная примерно с 1960 г., в дополнение к этим методам все шире используется принципиально иной физический метод - масс-спектрометрия. Основой масс-спектрометрии являются разделение ионов по величинам т/г (отношения массы к заряду) и измерение населенностей (интенсивностей) ионов каждого типа. Популярность метода легко объяснима, поскольку он позволяет определить молекулярную массу и молекулярную формулу практически любого вещества, расходуя ва это ничтожное количество образца.) Кроме того, осколочные ионы несут полезную информацию о структуре изучаемого вещества.- Масс-спектрометрия постоянно развивается как в инструментальном аспекте, так и в отношении методов ионизации, благодаря чему стало возможным регистрировать масс-спектры подавляющего большинства органических веществ, а в последние годы даже высокомолекулярных, термически неустойчивых и нелетучих соединений, например пояи-пептидов и белков с молекулярной массой более 10000. Эта глава посвящена интерпретации масс-спектров и их применению для определения строения органических веществ. [c.176]

Незащищенные олнгопептиды обладают низкой летучестью и практически не могут быть проанализированы масс-спектрометрическим методом. Для повышения летучести их превращают в Ы-ацильные производные 0-алкиловых эфиров. Масс-спектры таких производных позволяют устанавливать аминокислотную последовательность в олигопептидах на основе анализа двух общих типов фрагментации. Главным типом распада замещенных пептидов является аминокислотный тип фрагментации, обусловленный разрывами амидной связи с фиксацией заряда на карбонилсодержащих остатках (ион в). Этот тип распада часто осуществляется двухступенчато с образованием альдиминных фрагментов (ионы г) [504] [c.290]

Указанные общие направления фрагментации пептидов могут затушевываться или дополняться частными, зависящими от природы аминокислот, входящих в исследуемые пептиды. Например, наличие в составе пептида моноаминодикарбоновых кислот приводит к появлению в масс-спектре пиков ионов [(в)—А1кОН]+ и [(г)—А1кОН]+ [505]. При исследовании серосодержащих пептидов полезным оказалось их десульфирование или исчерпывающее Ы-метилирование. [c.291]

Хорошо известный метод Эдмана для определения аминокислотной последовательности в пептидах основан на образовании тиогидантоинов (12) за счет концевой аминокислоты при действии на пептиды соответствующего RN = = S. Масс-спектры таких тиогидантоинов достаточно характеристичны и облегчают задачу идентификации отщепленной аминокислоты [507]. Масс-спектры фенилтиогидантоинов (12, R = 6Hs), например, всегда содержат интенсивные пики М+ и пики ионов [СбН5]+ и [ eH5N = = S] + - (m/z 135). Если в (12) К >СНз, то из М+ легко отщепляется молекула (R —Н). [c.291]

Получающиеся в результате этих реакций полиамины имели при разделении в газовом хроматографе заметно меньшие удерживаемые объемы и давали более острые пики. С помощью масс-спектрометрии все изучаемые пептиды можно было идентифицировать в виде как полиаминоспиртов, так и полиаминов. Определенные аминокислоты в ходе двукратного восстановления теряют некоторые структурные особенности, а образующиеся из них продукты дают при масс-спектрометрии пики с одинаковым числом единиц массы и, следовательно, становятся неразличимыми. К ним относятся Ала и Сер, Вал и Глу, Про и Опр, а также а-аминомасляная кислота, Тре и Асп. В таких случаях их можно различить на масс-спектре, если восстановление вести в присутствии LiAlDi, когда восстанавливаемые группы метятся одним или несколькими атомами дейтерия [7]. Проиллюстрируем это на примере трех последних аминокислот при двукратном восстановлении боковая цепь а -аминомасляной кислоты (/) остается неизменной, в Тре (//) включается один атом дейтерия и в Асп IIГ)—три [c.340]

Рассматриваемые методы, конечно, имеют ограничения. Так, например, масс-спектр зависит от степени летучести и термической устойчивости веществ. Тем не менее масс-спектры были получены для многих соединений с большим молекулярным весом — стероидов, терпеноидов, пептидов, полисахаридов и алкалоидов — при введении образца вблизи ионизационного пучка. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса лимитируется растворимостью. Однако доступность многих дейтерированных растворителей и совершенствование микроЗлТ-пул, накопители сигналов и фурье-преобразование (гл. 4) позволяют получать адекватные спектры ЯМР и в разбавленных растворах. [c.14]

Определив по масс-спектру образующиеся фрагменты, можно в сочетании с другими физическими методами воссоздать структуру исходной молекулы. С этой целью масс-спектрометрия была использована для определения последовательности аминокислотных остатков в пептидах (М. М. Шемякин, Ю. А. Овчинников, И. С. Вульфсон), установления строения производных углеводородов (Н. К. Кочетков, О. С. Чижов). В настоящее время перспективным методом идентификации и структурного анализа смесей стала хроматомасс-спектромет-р и я, явивн1аяся результатом объединения в одном приборе газожидкостного хроматографа и масс-спектрометра. [c.511]

Масс спектры лазерной десорбционной ионизации были за регистрированы на этой системе для ряда нелетучих образ цов — аминокислот, пептидов нуклеозидов сахаридов В боль шинстве случаев предел обнаружения составлял 1 нг/ см и менее Основная трудность при работе с этой системой зак лючалась в отсутствии воспроизводимости как относительных интенсивностей пиков основных ионов так и их абсолютных интенсивностей Главный источник этих изменений — неодно родность покрытия поверхности ленты образцом примеси и фоновые загрязнения Непосредственное нанесение раствора образца на ленту с последующим испарением растворителя не дает удовлетворительных результатов так как степень смачи ва1шя ленты и движение жидкости по поверхности влияют на однородность слоя и как следствие на форму пиков [61] Для полного испарения растворителя при ограничении испаре ния образца необходим тщательный баланс между потоком растворителя и скоростью испарения [c.43]

ОТ отношения массы к заряду) в магнитном поле и наконец регистрация масс-спектра. Вследствие цвиттер-ионного характера пептиды с большим трудом подвергаются испарению. Летучесть их может быть повышена путем ацилирования и этерификации. Для ацилирования обычно используют трифторуксусный ангидрид или М-гид-роксисукцинимидный эфир жирной кислоты, например декановой. Этерификацию можно осуществить метанолом в присутствии каталитических количеств хлористого сульфурила. В ряде случаев прибегают также к переметилированию атомов азота в пептидных связях путем обработки ацилированного пептида иодистым метилом и гидридом натрия в диметилсульфоксиде. [c.71]

Идентификация пиков аминокислотных и альдиминных фрагментов в масс-спектре дает основную информацию о строении пептида (рис. 26). [c.72]

Одно нз преимуществ масс-спектрометрнческого метода заключается в возможности аналнзнровать пептиды, не содержащие свободной а-аминогруппы, и устанавливать химическую природу блокирующего остатка. При использовании электронной ионизации метод пригоден для анализа сравнительно коротких (4 — 6 остатков) пептидов. Границы возможностей масс-спектрометрии в изучении структуры пептидов резко расширились с введением более современных методов ионизации. Применив для этой цели бомбардировку ускоренными атомами, Г. Моррис показал, что можно получать масс-спектры пептидов, молекулярная масса которых достигает 3000, причем для определения структуры достаточно I — 5 нмоль вещества, т. е. в таком случае по чувствительности масс-спектрометрический метод не уступает другим методам. [c.73]

При ионизации полевой десорбцией масс-спектры пептидов состоят практически из одних молекулярных ионов. На этой основе Я. Шимониши был разработан метод исследования структуры белка путем непосредственного анализа смеси пептидов, получаемых после ферментативного гидролиза. Смесь пептидов подвергается деградации по методу Эдмана, и после каждого этапа, наряду с идентификацией отщепленных аминокислот, масс-спектрометрически по молекулярным ионам определяются молекулярные массы [c.73]

Характеристичные пики в масс-спектрах играют ведущую роль при установлении строения определенных типов природных соединений. Имея некоторый предварительный опыт, можно быстро получить ценную информацию при исследовании масс-спектров таких групп соединений, как пептиды, бензилизохинолиновые алкалоиды, индольные алкалоиды, стероиды и др. Поэтому, исследуя [c.77]

Рпс. 4.8. Частичный масс-спектр пептида Z-Val-Gly-OMe при IGO (а) и 250° С (б). Оба спектра записаны в процентах от. . акси.мальпого [c.94]

Ионы типа А при отщеплении СО могут давать ионы типа Б. Обычно в пептидной цепи расщепляются все связи СО—ЫН с образованием фрагментных нонов А и из анализа масс-спектра удается определить аминокислотную последовательность. Свободную концевую аминогруппу пептида обычно ацетилируют, а концевую карбоксильную группу превращают в метиловый эфир. Этерн-фицированный и ацетилированный таким образом трн- [c.122]

Если квазимолекулярные ионы обладают достаточной энергией, они диссоциируют с образованием четноэлектронных фрагментных ионов. Результаты, полученные до сих пор методами химической ионизации, показывают, что квазимолекулярные ионы, по-видимому, не обладают большой избыточной внутренней энергией. Поэтому при химической пэннзации в масс-спектре преобладают квазимолекулярные ионы наряду с сильно уменьшенным количеством фрагментных ионов. Так, например, многие биологически важные соединения, такие, как терпены, стероиды, сахара, нуклеозиды, пептиды и алкалоиды, дают интенсивные пики, соответствующие квазимолекулярным ионам [М + П]+. [c.225]

При химической ионизации часто используются ионы типа СН5, эти ионы были впервые обнаружены В. Л. Тальрозе, при ионно-мо-лекулярной реакции Нг +СН4 —> СНб +Н.При взаимодействии ионов СН5 с молекулами исследуемого образца последние ионизуются. Механизм ионизации при ионном ударе существенно отличается от механизма электронной бомбардировки, соответственно спектры химической ионизации отличаются от масс-спектров и несут дополнительную информацию о структуре молекул органических соединений. Широкое развитие метода несколько тормозится сложностью его аппаратурного оформления. Проводилось сопоставление масс-спектров алканов, полученных методом химической ионизации и. ионизации в поле [43]. При изучении пептидов и других термически нестабильных и (или) труднолетучих соединений применение химической ионизации, так же как и ионизации полем, позволяет получить важную информацию о строении [44]. [c.27]

Говоря о применении малолинейчатой масс-спектрометрии в качественном анализе, нельзя не упомянуть о фотоионизации, позволяющей в весьма мягких условиях получить масс-спектр соединений в близпороговой области. Так, исследование цис- и трансизомеров 4-третбутилциклогексанона [730] при энергии фотонов 21,2 эв позволило получить весьма интересные данные, связывающее структуру конфорМеров с величиной пика Mi и (М—H2Q)i [731, 732]. Фотоионизационным методом исследовались аминокислоты, пептиды и другие сложные высокомолекулярные систему, имеющие большое значение для химии природных соединений [733]. [c.296]

В масс-спектре сильный фон, непосредственная комбинация методов ограничивается исследованиями низших пептидов и в меньшей степени пригодна для изучения более длинных пептидов при тех высоких температурах, которые необходимы для газохроматографического разделения. По этой причине метод улавливания соединений после колонки с целью дальнейшего масс-спектрометрического исследования кажется более удобным для высших пептидов, например три- и тетрапептидов. Недавно Байер и Кёниг [18] сообщили о применении комбинированного прибора газовый хроматограф — масс-спектрометр для разделения пептидных производных, но, вероятно, из-за обсуждавшихся выше трудностей приведенные масс-спектры сканировались с использованием системы прямого ввода прибора. [c.156]

Первое исследование по использованию масс-спектрометрии для определения аминокислотной последовательности было опубликовано Бименом и сотр. [8]. Они предложили восстанавливать пептидные связи и концевую карбоксильную группу литий-алюминийгидридом для получения полиаминоспиртов, содержащих диаминоэтановые остатки вместо амидных групп. Такие полиаминоспирты, полученные из коротких пептидов (не больших, чем пентапептид), достаточно летучи и дают интерпретируемые масс-спектры. [c.190]

Пики в масс-спектрах полиаминоспиртов могут быть однозначно идентифицированы сравнением их с масс-спектрами соответствующих дейтерированных производных, полученных восстановлением пептидов литийалюминийдейтеридом. Сравнение двух масс-спектров показывает, что пики сдвинуты в соответствии с тем, что каждая исходная карбонильная группа превращается в СОг, а не в СНг. [c.190]