Седиментация в градиенте сахарозы

Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов достаточно кратковременного последовательного центрифугирования при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорением) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положеиие каждой фракции и содержание в ней РНК. [c.163]

Основными оцениваемыми характеристиками РНК являются, как и в случае ДНК, молекулярный вес и нуклеотидный состав Молекулярный вес РНК можно определить с помощью метода светорассеяния или химически — определением концевых групп (см. стр. 44) чаще для этой цели пользуются ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы. Предложен ряд эмпирических уравнений, связывающих константу седиментации в определенных [c.36]

Метод центрифугирования в градиенте плотности имеет две разновидности метод, основанный на измерении скорости седиментации в градиенте сахарозы, и метод равновесного центрифугирования, в котором используется градиент хлористого цезия. В первом варианте используется заранее приготовленный градиент, а во втором — градиент создается под действием поля центробежных сил непосредственно в ходе эксперимента. [c.417]

Седиментация в градиенте сахарозы [c.130]

Зональная седиментация РНК, синтезируемой из матричной ДНК фага "К Е. соИ (градиент сахарозы 5— [c.314]

В 2 раза меньше истинного. Для определения количества атомов на интактную молекулу ДНК реакционную смесь можно проанализировать путем седиментации через градиент сахарозы (рис. 11-27), Рисунок показывает (причем такая ситуация часто встречается на практике), что значительная часть радиоактивности практически не седиментирует, оставаясь в верхнем слое гра- [c.315]

Андерсон [160] описал устройство применяемое для формирования градиента (рис, 19). Прибор СОСТОИТ из двух шприцев, содержащих два раствора различной плотности. Шприцы присоединены общим выводным капилляром, где происходит смешивание растворов. Капиллярную трубку опускают в центрифужную про-бирку. При постоянной скорости поршней в шприцах концентрация сахарозы в растворе, оттекающем из устройства изменяется линейно со временем. При этом в центрифужной пробирке создается линейный градиент сахарозы. Такой сформированный градиент стабилен в течение нескольких часов. Кроме линейного градиента, такое устройство может формировать градиенты других форм при помощи кулачков различной формы которые изменяют скорость движения поршней по любой заданной программе. Эти различные формы градиента можно использовать ддя разделения смесей, содержащих компоненты с различной скоростью седиментации или плотностью. Например, если смесь содержит три компонента плотностью 1,12, 1,14, 1,25 г/мл, идеальный градиент в этом случае должен иметь 8-форму. Он должен быть пологим в зоне плотности от 1,10 до 1,16 г/мл, чтобы первые два компонента, близкие по плотности, достаточно хорошо отделились за определенное время. Затем градиент должен быть крутым в зоне плотности от 1,16 до 1,30 г/мл, чтобы третий компонент расположился на некотором расстоянии от дна пробирки. [c.203]

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Наиболее широкое применение нашел метод изоэлектрической фокусировки. Он основан на создании под действием внешнего электрического поля стабильного градиента pH, причем значение pH возрастает от анода к катоду. В такой системе каждый белок перемещает в том или ином направлении в соответствии со знаком своего заряда до тех пор, пока не достигнет участка, в котором значение pH совпадает с его изоэлектрической точкой. На этом участке дальнейшее его перемещение под действием электрического поля прекращается, так как его заряд становится равным нулю. Приложенное поле, поддерживающее стабильный градиент pH, препятствует также диффузному размыванию зоны. Механизм аналогичен только что рассмотренному эффекту градиента плотности раствора сахарозы на стабилизацию зон при седиментации. Действительно, если в результате диффузии белок уходит из участка, на котором pH = р1, в сторону катода, он попадает в область более высоких значений pH и заряжается отрицательно. Под [c.243]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Четко разграниченные пики, приведенные на фиг. 7, А, соответствуют полисомам, коэффициенты седиментации которых свидетельствуют о том, что они содержат одну, две, три, четыре и т. д. рибосом. В свою очередь центрифугирование в градиенте плотности сахарозы позволяет отделить 808-частицы от более тяжелых и более гетерогенных полисом (фиг. 7, Б). [c.26]

При использовании метода, основанного на измерении скорости седиментации, градиент сахарозы может быть заранее приготовлен с помощью автоматического устройства, создающего градиент. Раствор, содержащий макромолекулярные частицы, осторожно наслаивают сверху. Хотя в результате такого наслаивания в верхней части раствора образуется область отрицательного градиента плотности, слой частиц поддерживается очень сильным положительным градиентом плотности сахарозы, которая препятствует осаждению каиелек жидкости и обеспечивает постоянную скорость миграции крупных молекул. В ходе центрифугирования под действием центробежных сил частицы мигрируют сквозь столбик жидкости и распределяются по дискретным зонам. Каждая зона содержит только молекулы одного типа, движущиеся вдоль градиента с характерной для них скоростью седиментации. По истечении заранее намеченного времени центрифугу останавливают, пробирки вынимают из ротора и тем или иным способом отбирают фракции. Поскольку в данном методе за расположением границ в процессе центрифугирования наблюдать невозможно, приходится действовать вслепую. В связи с этим для определения промежутка времени, оптимального для разделения на фракции, приходится проводить несколько пробных центрифугирований. [c.417]

Точно так же, как для оценки времени осаждения в ультрацентрифуге компонента с данным ко фициентом седиментации s используются параметры ST, Pi или k, можно предложить аналогичный параметр к для зонального центрифугирования в градиенте плотности. В табл. 7 (данные фирмы Be kman Instruments In .) приведены значения этого параметра для различных роторов, выпускаемых этой фирмой. С помощью фактора к можно определить время, необходимое для седиментации частиц с данным коэффициентом седиментации и данной плотностью в градиенте плотности от мениска до дна пробирки. В таблице приведены девять значений этого фактора для различных роторов и для частиц с плотностями от 1,1 до 1,9 г/мл, седиментирующих в линейном градиенте сахарозы (5—20% по массе) при 5°С. [c.198]

Рис. 1. Седиментация препаратов суммарной РНК нормальных (Л) и облученных ( ) зародышей вьюна. РНК выделяли на стадии 8 час. развития после 2,5-часовой инкубации икры с С -карбонатом (15 мккюри/.чл смеси). Препарат РНК обрабатывали ДНК-азой. Центрифугирование проводили в градиенте сахарозы 5—20%, содержащей 0,1 М натрий-ацетатный буфер pH 5 и ЭДТА (0,01, М) в течение 12 час. при 10°С в роторе 5 У-25 ультрацентрифуги Спинко Ь

Мартин и Амес [12] показали, что скорость двин ения нескольких белков через градиент сахарозы линейно зависит от времени. Это позволяет определить константу седиментации неизвестного веш ества, центрифугируя его в сахарозном градиенте в присутствии сходного с ним веш ества, для которого константа седиментации известна. Для расчета пользуются уравнением [c.136]

По приблизительной величине s часто бывает удобно идентифицировать молекулы, которые исследуются только с помощью седиментации в градиенте сахарозы. В молекулярной биологии, в особенности при изучении различных видов РНК, константа седиментации имеет двойное назначение. С одной стороны, эта величина является точной и достаточно надежной характеристикой физико-химических свойств молекулы, а с другой стороны, константа седиментации используется для обозначения этих молекул. Так, мы называем их 18S и 28S-PHK или 16S- и 23S-PHK вместо того, чтобы говорить крупные и мелкие молекулы рибосомной РНК, полученные соответственно из высших организмов или микроорганизмов . Возможно, с точки зрения чистоты языка такие обозначения и нежелательны, однако на практике они удобны и сейчас широко уиотребляются. [c.137]

При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить (см. рис. 4-43). Скорость седиментации каждого из компонентов определяется его размерами и формой и обычно выражается с помошью коэффициента седиментации, обозначаемого 8 (см. табл. 4-7). Ротор в современных центрифугах вращается со скоростью до 80000 об/мин, так что на разделяемые частицы действуют силы, превосходящие силу тяготения более чем в 500000 раз. Под действием столь больших сил даже сравнительно небольшие макромолекулы, такие, как тРПК или простейшие ферменты, разделяются и распределяются в строгом соответствии со своими размерами. Измерение коэффициента седиментации макромолекулярных комплексов обычно используют для определения их общей массы и количества входящих в их состав субъединиц. [c.209]

Если требуется получить точные значения коэффициентов седиментации при помощи препаративного центрифугирования в градиенте плотности, то наилучшим решением является создание изокинетичесшго градиента. Последний формируется таким образом, чтобы за счет отношения Ц - К2р(дг)]/Ь(дг)] полностью скомпенсировать прирост ускоряющей силы с увеличением X Аппроксимацией такого градиента может служить надлежащим образом подобранный экспоненциальный градиент какого-либо компонента раствора, при добавлении которого р и 1 раствора изменяются пропорционально его концентрации. Тогда коэффициент седиментации является линейной функцией пройденного расстояния. При этом не следует забывать, что величины К2 препаратов и стандартов должны совпадать. Надо также отдавать себе отчет в том, что в концентрированной сахарозе могут обнаружиться заметные термодинамические эффекты, связанные с трехкомпонентно-стью системы. При правильном подходе, однако, центрифугирование в градиенте сахарозы является чрезвычайно эффективным средством исследования. [c.252]

Однонитевые разрывы ДНК. Индуцированные облучением однонитевые разрывы ДНК (ОР) впервые были продемонстрировены с помощью метода "седиментации в щелочном градиенте сахарозы". Для продольного разделения ДНК на составляющие ее нити используют экстремальные щелочные условия (pH = 12). Клетки помещают в специально при-готовленнь1Й раствор сахарозь , затем центрифугируют при большой скорости. [c.35]

Если же в состав препарата входят частицы с очень больщи-ми значениями константы седиментации и есть необходимость затормозить их оседание при подходе ко дну пробирки, то используют либо более крутые линейные градиенты (с диапазоном 20 или 25%), либо градиенты вогнутой формы. Увеличение крутизны градиента приводит к сужению полос (зон) частиц. Передний край зоны, вступая в область повышенной вязкости и плотности раствора сахарозы, замедляет свое движение по сравнению с задним краем. Однако по той же причине уменьшается и расстояние между зонами, поэтому разрешение (разделение) зон или пиков не очень зависит от крутизны градиента. Если разделяют вещества с близкими значениями ао, . то берут пологие градиенты плотности, а узость зон стараются обеспечить за счет тонкости начального слоя. Компенсировать при этом уменьшение объема препарата за счет увеличения концентрации вещества в нем можно лишь в определенных пределах. Дело в том, что плотность раствора препарата накладывается на плотность градиента сахарозы. В силу диффузии препарат внутри зоны распределен неравномерно, профиль распределения имеет форму колокола. Если концентрация препарата в зоне невелика, то это наложение не нарушит общего характера нарастания плотности градиента вдоль пробирки. Если же концентрация вещества в зоне значительна, то у переднего ее края образуется локальный участок обратного градиента плотности , т. е. плотность на этом участке убывает (за счет препарата) в направлении от мениска к дну пробирки. Это приводит к конвекции жидкости и размыванию зоны. Ясно, что чем круче градиент плотности сахарозы, тем меньше скажется на нем вклад плотности препарата. Именно поэтому для пологих градиентов сахарозы следует опасаться перегрузки зон при увеличении концентрации препарата в исходном слое. Довольно часто плохое разрешение зон при зональ- [c.213]

Теперь в пашем распоряжении имеются все данные для построения номограмм зависимости величины а от местоноложепия частицы и характера градиента сахарозы. Местоположение частицы будем характеризовать отношением х//. х—расстояние, пройденное частицей от мениска, Ь — длина пробирки). Величина а входит в простое выражение, описывающее измеиение скорости оседания частицы при ее движении вдоль градиеита ь = = 4 10- Константа седиментации частиц при выбо- [c.225]

Из очищенных ядер РНП-частицы экстрагировали при 37 0,01 М Трис-H l (pH 8) с 0,1 М Na l и 1 мМ АТФ (АТФ способствует выходу частиц из ядра). Их собирали центрифугированием при 60 000 об/мик в течение 4 ч и предварительно очищали зонально-скоростным центрифугированием в градиенте сахарозы, собирая фракцию с константой седиментации около 40S. Эту фракцию переносили в полиалломерные пробирки ротора SW 41, фиксировали добавлением глутарового альдегида до 6% в течение 1 ч при 0°, а затем смешивали с концентрированным водным раствором s l с таким расчетом, чтобы исходная плотность при центрифугировании составляла 1,5 г/ м а объем смеси —5 мл. Остальной объем пробирки (8 мл) заполняли парафиновым маслом. Центрифугирование вели при 30 000 об/мии и 25 в течение 60 ч. Собирали 30 фракций. 40 S РНП-частицы выходили острым пиком в области р= 1,4 г/см . Аналогичным образом исследовали плавучую плотность рибосом, а по ней определяли содержание в них белка. Рибосомы фиксировали обработкой 6%-ным раствором формальдегида. [c.262]

Пример 11-3. Измерение изменений величины мутантного фермента. Многие методы, применяемые для определения молекулярных масс ферментов, требуют образцов с высокой степенью очистки (например, метод седиментационного равновесия, который будет описан позже) или при использовании не очень чистых образцов дают массы субъединиц (например, ДСН-гель-электрофорез, гл. 9). Использование зональной седиментации позволяет определить молекулярную массу активного фермента непосредственно в неочищенном лизате при применении в качестве метода контроля анализа ферментативной активности. Например, ДНК-полимераза I Е. oli седиментирует при 5 = 5,4. Зоны полимери-зующей и 5 —З -экзонуклеазной активности, связанные с этим белком, седиментируют вместе, поэтому для локализации фермента в градиенте сахарозы можно использовать любую из них. Мутантная форма фермента не обладает полимеразной активностью, однако сохраняет 5 —З -экзонуклеазную. Как следует из рис. 11-26, мутантный фермент обладает значением s = 2,8. Поскольку данная мутация является терминирующей цепь белка, пониженное значение 5 указывает на то, что данный фермент является лишь небольшим фрагментом белка дикого типа и имеет только 0,4% активности. [c.314]

Зональная седиментация ДНК-полимеразы I Е. соИ, выделенной из дикого штамма (Л) и из штамма, синтезирующего только фрагмент фермента ( , в градиенте сахарозы 5--207о. [c.315]

Пример 11-К- Частичная очистка осмотически нестабильной структуры, содерокащей гормон. Из гипоталамуса крысы можно выделить гормон, носящий название вещества Р. Дороти Фрайфелдер и Сьюзен Лимен обнаружили, что гормон может выпадать в осадок из мацерированной ткани при очень малой центробежной силе, если ткань перед разрушением клеток суспендировать в 20%-ной сахарозе в отсутствие сахарозы он не седиментирует даже при очень большой центробежной силе. Отсюда было сделано предположение, что гормон содержится в осмотически нестабильных частицах. Седиментация этих частиц через градиент сахарозы (от 5 до 20%) оказалась невозможной, так как слой образца немедленно опускался на дно. Применить градиент от 25 до 70% было нельзя, так как частицы, по-видимому, разрушались при высокой осмотической силе. Для решения этой проблемы был получен градиент из 20%-ной сахарозы в Н2О и 20%-ной сахарозы в ОгО. Полученный таким образом градиент достаточно стабилен за счет того, что ОгО на 11% плотнее Н2О, а постоянная концентрация сахарозы поддерживает необходимую силу осмоса. Седиментация через такой градиент дала возможность получить частично очищенные частицы. [c.316]

Единственное осложнение при использовании этого метода заключается в том, что сахароза при высоких концентрациях проявляет заметные буферные свойства в диапазоне pH 10—И. Кроме того, ее буферная емкость существенно возрастает с понижением температуры. Таким образом, д.пя приготовления щелочных градиентов сахарозы нельзя применять разбавление буфера с pH 12,5 с последующим прибавлением сахарозы. Чтобы обеспечить денатурацию, pH доводят до нужного значения после добавления сахарозы, причем это необходимо делать при той же температуре, при которой будет проводиться седиментация. Применение 0,3 М ЫаОН позволяет решить эту проблему. Все щелочные растворы сахарозы должны содержать хелатирующий агент, такой, как ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), для предотвращения катализируемого ионами металлов гидролиза фосфоднэфирных связей. [c.319]

Пример 11-Л. Идентификация небольилих фрагментов вновь синтезируемой ДНК фрагменты Оказаки, При выращивании бактерии Е. соИ в среде, содержащей Н-тимидин, в течение многих поколений синтезируемая ДНК будет включать Н. Прн выделении этой ДНК и седиментации при нейтральном pH установлено, что значение s указывает на ее высокую молекулярную массу. Однако при седиментации этой же ДНК в щелочном градиенте сахарозы оказалось, что небольшая часть ДНК седиментирует очень медленно (рис. 11-34, Л). Из этого было сделано предположение, что часть двухцепочечных молекул ДНК содержит близко расположенные одноцепочечные разрывы. Если нерадиоактивные клетки выращивать в течение всего лишь 5 с (0,2% поколения) в радиоактивной среде, затем отделять и анализировать в щелочном градиенте сахарозы, оказывается, что ббльшая часть радиоактивности (т. е. вся ДНК, синтезированная за период 5 с) содержится во фракции с очень малым 5 (рис. 11-34, Б). Синтезированная за это время ДНК должна иметь множество близко расположенных одноцепочечных разрывов. Если клетки после выращивания в течение 5 с в радиоактивной среде перенести вновь в нерадиоактивную и выращивать в ней в течение 10 мин (74 поколения), седиментационный анализ в щелочном градиенте сахарозы показывает, что вся радиоактивность находится во фракции с высоким s (рис. 11-34, ), т. е. старая ДНК не содержит одноцепочечных разрывов. Эти [c.322]

Рис. 5-28. Отделение полирибосом от свободных рибосом(и отих субъединиц) с помощъю центрифугирования. Метод основан натом, что крупные молекулярные агрегаты движутся в сильном гравитационном поле быстрее, нежели мелкие. Обычно седиментацию проводятв градиенте сахарозы, чтобы стабилизировать раствор - предотвратить его перемешивание за счет конвекции.

Седиментация под влиянием центрифугирования происходит при скорости, зависящей от размера капель эмульсии. Пинтер и Зильвесмит (1962) фракционировали эмульсии М/В по размерам частиц седиментацией в колонке с сахарозой. Они получали слои с различными плотностями. Градиент плотности создавали при смешивании 50 и 30% растворов сахарозы. Смесь помещали в пробирку емкостью 100 и далее вводили 1 мл эмульсии М/В в 50% растворе сахарозы. В нижнюю часть пробирки вводили 5 мл 60% раствора сахарозы. Центрифугирование проводили при скорости до 2800 об1мин. [c.153]

Для биофизики важен метод седиментации в градиенте плотности. В концентрированном растворе низкомолекулярного но-щества (в СзС1, в сахарозе и т. д.) при ультрацентрифугироиа-нии устанавливается градиент концентрации, т. е. градиент плотности растворителя макромолекул фо/йх. В таком растворе мак[)о-молекулы будут располагаться в той части кюветы, в которой 5 = 0, т. е. согласно (3.66), Умро = 1 или ро = рм- Иными словами, макромолекулы локализуются в той области кюветы, где плотность концентрированного раствора совпадает с плотностью макромолекул (р измеряется непосредственно). Гетерогенная смесь макромолекул разделяется и наблюдается спектр плотностей. Этот метод с большой эффективностью применяется при изучении нуклеиновых кислот. [c.82]

Для седиментационных экспериментов удобной средой является забу-ференный раствор сахарозы с линейным градиентом плотности (обычно между 5 и 20%). Такой градиент можно создать в центрифужных пробирках до начала работы при помощи простого аппарата для перемешивания. В ряде случаев вместо сахарозы используют самообразующийся градиент плотности хлористого цезия. Седиментацию вещества в градиенте плотности можно регистрировать непрерывно при помощи ультрафиолетовой оптики, которой снабжена аналитическая центрифуга. Вместо этого можно также просто прокалывать дно пробирки или отбирать пробы с помощью сифона, опущен-в ого до самого дна пробирки. Отобранные пробы собирают в отдельные пробирки на коллекторе фракций. Концентрацию вещества в каждой из фракций определяют по поглощению света (в ультрафиолетовой области при 260 ммк), по реакционной способности (содержание дезоксирибозы), по биологической активности, по содержанию определенной радиоактивной метки (например, Р ) и т. д. [c.138]

Для определения молекулярного веса ДНК (обзоры — см. наиболее широко используются методы, основанные на определении скорости седиментации макромолекул. Это определение может быть выполнено по различным методикам наиболее широкое распространение в последнее время приобрела методика, основанная на зональном центрифугировании в градиенте плотности сахарозы в препаративной ультрацентрифуге В данном случае распределение веществ по скорости осаждения можно контролировать по радиоактивной метке, что обеспечивает высокую чувствительность с другой стороны, методика практически без изменений может быть применена и для препаративного разделения нуклеиновых кислот. Предложен ряд эмпирических уравнений, связывающих скорость седиментации двухцепочечного комплекса ДНК со значением молекулярного веса определенным независимыми методами. Последнее из этих уравнений охватывает пределы мол. веса 0,2— 130 108. [c.30]

Процесс установления равновесия иногда занимает день или больше. Поскольку при таких больших сроках возможны денатурация или бактериальное загрязнение, искажающие результаты эксперимента, разработан ряд приемов, позволяющих ускорить установление равновесия. Длительность этого процесса прямо пропорциональна квадрату высоты столба жидкости. Если оиа равна 1—3 мм, процесс установления равновесия длится в течение нескольких часов. Для ячеек с высотой столба жидкости 0,8 мм это время при седиментации сахарозы, рибонуклеазы и бычьего сывороточного альбумина равно соответственно 15, 45 и 70 мин. Однако при таких размерах снижается точность и чувствительность к гетерогенности, хотя в этом случае можно работать при больших угловых скоростях. С помощью многоканальных ячеек производится одновременное определение нескольких концентраций при одинаковой температуре. К уменьшению времени достижения равновесия приводит также такой режим вращения ротора, при котором начальное значение скорости выбирается несколько завышенным и затем постепенно снижается. Концентрацию можно измерять с помощью интерференционного метода Релея, а молекулярный вес рассчитывать, используя значение градиента концентрации в точке перегиба (т. е. средней точке на фиг. 35, Л). Для обеспечения постоянства скорости, необходимого в некоторых экспериментах по седиментационному равновесию, лучше всего использовать магнитную подвеску стального р тора в высоком вакууме. В этих условиях скорость уменьшается всего на 1 об1мин за сутки. [c.194]

А. Разделение путем аналитического ультрацентрифугирования (с использованием шлирен-оптики). Пик 1 соответствует 808-рибосомаи, пики г, 3, 4 а 5 соответствуют частицам, содержащим 2 рибосомы (коэффициент седиментации 1103), 3 рибосомы, 4 и 5 рибосом соответственно [1]. В. Отделение рибосом от полисом миксомицета путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Ник справа соответствует полисомам, в состав которых входит от 2 до 20 и более рибосом [26]. [c.26]

Лоунстейном и Бирнбаумом, которые сконструировали аппаратуру, основанную на использовании модифицированной препаративной центрифуги, которая позволяет одновременно измерять 5 и Д при изучении седиментации полимеров в капилляре с помощью фотодетектора, сканирующего капилляр, причем градиент плотности сахарозы не используется [50]. В другой недавно опубликованной работе [51] описывается разделение смесей заряженных полиэлектролитов в колонке с полиакриламидным гелем путем электрофореза с периодическим включением электрического поля и последующее определение Д для фракций методом КРЛС. [c.188]

Наномним, что нри центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не ни различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, п при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэ/ому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифуг гированием в градиенте солей цезия, которое широко иснользуется для разделения молекул по их плавучей плотпостп. [c.127]

Поскольку мы получили удовлетворительное уравнение, связывающее молекулярный вес РНК с ее характеристической вязкостью и константой седиментации, было бы желательным располагать надежными уравнениями, связываюпщми молекулярный вес с канодым из этих параметров в отдельности. Хотя несколько подобных уравнений и опубликовано в литературе, они были выведены на основании изучения какого-то одного типа РНК в определенном растворителе и, строго говоря, применимы только для той же РНК в том же растворителе. Это связано с тем, что конформация РНК меняется с изменением температуры и ионной силы раствора. Поэтому не может быть универсального уравнения, связывающего константу седиментации РНК с ее молекулярным весом, и прямого способа расчета молекулярного веса по константам седиментации, обычно получаемым из данных седиментации в градиенте концентрации сахарозы. Чтобы проиллюстрировать, каким образом могут различаться [c.260]

Этот метод, изобретенный в середине 50-х годов, чрезвычайно облегчил исследование структуры и функции субклеточных структур вообще и рибосом в частности, С помощью этого метода, схематически показанного на фиг. 195, можно разделить на фракции смесь веществ, седименти-рующих с разной скоростью. На фиг. 195, Б п В показаны кривые седиментации двух клеточных экстрактов в градиенте плотности сахарозы. Как видно из фиг. 195, Б, к концу 15-секундного периода метки более половины атомов находится в составе растущих полипептидных цепей, которые седиментируют вместе с 705-рибосомами. Остальная же часть метки находится в уже завершенных свободных белковых молекулах, которые седиментируют гораздо медленней. Из фиг. 195, В видно, что за 120 с после добавления S0 2 и прекращения включения атомов большая часть метки ранее находившейся в растущих полипептидных цепях, связанных с рибосомами, перешла в медленно седиментирующую фракцию, состоящую из завершенных молекул белка. [c.388]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология