Силикагели ферментов

Круг использования ферментов расширяют иммобилизованные ферменты. В качестве носителя чаще всего применяют природные или синтетические высокомолекулярные вещества, используют и неорганические носители (силикагели, керамику, пористое стекло и др.). Иммобилизованные ферменты практически нерастворимы. Это новый тип катализаторов с повышенной устойчивостью, использование которых становится экономически эффективным. [c.187]

Для того чтобы обеспечить многократность использования ферментов, их подвергают иммобилизации. Иммобилизацией называют перевод ферментов, обычно растворимых в воде, в водонерастворимое состояние с сохранением их каталитической активности. Молекулу фермента присоединяют за счет образования ковалентной связи к какому-либо водонерастворимому носителю — целлюлозе, стеклу, бумаге, силикагелю, полистиролу и др. Можно также диспергировать фермент в геле какого-либо вещества. [c.450]

Продолжали появляться успешные доказательства того, что силикагели могут специфически адаптироваться к адсорбции различных типов молекул гормонов [385], большого ряда разновидностей органических оснований и их изомеров [386, 387] и даже ферментов [388]. [c.763]

Как и при разделении на ранее описанных полимерных ХНФ, механизм хирального распознавания в данной системе является сложным и до конца не выяснен. Однако основные причины удерживания сорбата были выявлены в ходе систематических исследований влияния его структуры и состава подвижной фазы на коэффициент емкости. Во многих отношениях альбумин-силикагелевый сорбент ведет себя подобно обращенно-фазовым материалам на основе алкилированного силикагеля. Спирты, преимущественно пропанол-1, помогают регулировать время удерживания, поскольку вызывают его быстрое уменьшение вследствие ослабления гидрофобных взаимодействий с сорбентом. Оптимизировать состав подвижной фазы можно, варьируя тремя основными параметрами, а именно pH, ионной силой и органическим растворителем-модификатором [90]. Вероятно, в любой хроматографической системе одновременно наблюдается влияние диполь-ионных и гидрофобных взаимодействий. Кроме того, возможно образование водородных связей и комплексов с переносом заряда. Большое влияние свойств подвижной фазы на значения к разделяемых энантиомеров можно объяснить зависимостью свойств белков от распределения заряда и его конформации. БСА состоит как минимум из 581 остатка аминокислот, связанных в единую цепь (мол. масса 6,6-10 ), и его надмолекулярная структура в значительной мере определяется присутствием в молекуле 17 дисульфидных мостиков. При рН7,0 полный заряд молекулы равен - 18, а изоэлектрическая точка равна 4,7. Как это хорошо известно из химии ферментов, смена растворителя способна вызывать изменения в структуре связывающего центра белка в результате изменения его заряда и конформации. [c.133]

Предварительные опыты показали, что каталаза может быть адсорбирована иэ ВОДНОЙ вытяжки активированным углем или силикагелем. Однако активированный уголь обладает "собственной каталазной активностью, маскирующей поведение фермента. Поэтому в качестве адсорбента-<носителя нами был взят силикагель ШСК (шихтовый силикагель крупнопористый), не обладающий каталазным действием. [c.338]

Тизелиус [126] сообщил, что белки, ферменты и другие высокомолекулярные вещества в присутствии растворов солей адсорбируются весьма сильно на некоторых адсорбентах, которые в растворах, не содержащих соли, имеют очень слабое сродство к этим веществам или вообще не адсорбируют их. Шепарду и Тизелиусу [114] удалось полностью адсорбировать овальбумин и сывороточный альбумин на колонке из силикагеля путем увеличения ионной силы растворов, из которых адсорбировались белки. В той же лаборатории была исследована распределительная хроматография ряда белков на колонках из фосфата кальция [128]. [c.331]

Показана [124] успешная возможность сочетания методов тонкослойно-хроматографического ингибирования ферментов и полярографии для анализа фосфорорганических пестицидов — метатиона и его аналогов. Сорбентом служит силикагель для проявления хроматограммы использовали систему петролейный эфир (фракция, перегоняющаяся при 60—80 °С) — ацетон (3 1) ферменты — препараты эстераз. После опру- [c.88]

Непрерывно улучшаются также и сами технологические схемы производства ферментных препаратов. Поверхностное выращивание все более заменяется глубинным. Вводятся новые приемы концентрирования и очистки например, разработана технология сорбции амилазы на силикагеле или модифицированном крахмале, глюкозооксидазы на каолине разрабатываются способы промышленного получения многих ферментов, в частности протеолитических с применением ионообменных смол и т. п. [c.201]

Молекулярная сорбция некоторых ферментов определенными ионитами может быть резко повышена за счет процесса высаливания (адсорбция высаливанием), что, как будет показано ниже, проявляется при сорбции амилазы силикагелем и крахмалом. [c.86]

СОРБЦИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ СИЛИКАГЕЛЕМ [c.99]

Установлено, что с увеличением концентрации амилазы в ферментном растворе сорбция фермента повышается. Так, сорбция амилазы из приготовленного ферментного раствора с активностью. АС 12 ед мл составила 60 ед г силикагеля, а при активности 3 ед/мл сорбировалось всего 10 ед. АС на 1 г сорбента. [c.102]

Разработаны оптимальные условия и принципиальные технологические схемы сорбции амилазы из культуральной жидкости силикагелем в динамических и статических условиях. Приведен механизм сорбции ферментов ионитами. Показано, что сорбция может протекать за счет поверхностно-молекулярного взаимодействия без ионного обмена, а также за счет сил Ван-дер-Ваальса в сочетании с ионообменным процессом и путем так называемой сорбции высаливанием (силикагель, крахмал). Возможна также сорбция ферментов способом гель-фильтрации с одновременным взаимодействием с матрицей молекулярного сита (сефадекс А-50). [c.116]

В определенных условиях упругие колебания существенно ускоряют процесс сушки. Например, П. Грегуш отмечает десятикратное ускорение сушки хлопкового волокна в звуковом поле с частотой 25 кгц. Значительную интенсивность сушки порошкообразных, пористых и волокнистых материалов (карбоксилэтплцеллюлоза, паста двуокиси титана, коллоидная гидроокись циркония, силикагель, ферменты, гормоны, бумага, картон) наблюдали при частоте 10 кгц Е. Брун и Р. Ж- Буше. [c.4]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Биоспецифическая хроматография применяется для очистки ферментов, так как она позволяв извлекать ферменты из сложных смесей в одну стадию с высокой степенью очистки и с большим выходом. В последнее время в качестве адсорбентов-носителей в биоспецифической хроматографии находят применение как макропористые неорганические адсорбенты (силикагели, силохромы, пористые стекла), так и макропористые органические сшитые сополимеры, например макропористые сополимеры глицидилме-такрилата с этилендиметакрилатом типа сферой (см. лекцию 6) со сферическими зернами разных размеров. Эти адсорбенты-носители обладают разной удельной поверхностью и крупными порами разных размеров. На рис. 18.10 представлен пример биоспецифической хроматографии химотрипсина на сфероне с иммобилизованным химической прививкой белком — ингибитором трипсина (являющегося также ингибитором химотрипсина). Из колонны, заполненной обычным макропористым сфероном без иммобилизованного ингибитора, химотрипсин выходит вместе с остальными белками, а из колонны, заполненной сфероном с привитым ингибитором, сопутствующие белки выходят приблизительно за то же время, а химотрипсин прочно удерживается. Это позволяет отделить [c.342]

Теперь задача сводилась к концевому анализу каждого пятна. Фрагменты гидролизовали РНКазой Т1 прямо на пластинке (2— 4 мкл раствора фермента прикапывали в центр пятна, закрывали парафильмом, прижимали его стеклом и инкубировали в течение ночи). Затем пятно вырезали, материал переносили в угол нластпнки силикагеля (прижимали двумя магнитиками) и вместе со свидетелями — смесью холодных нуклеозидтриспиртов — фракционировали двумерной распределительной ТСХ. Элюцию вели в первом направлении смесью ацетонитрил—трет-амиловый спирт—аммиак (2 1 1), во втором —mjDem-амиловый спирт—метилэтилкетои—вода (3 6 1,2). Пятна свидетелей вырезали под УФ-светом и просчитывали в них радиоактивность. Таким образом идентифицировали один за другим все нуклеотиды с 5 -конца, начиная со второго 5 -концевой нуклеотид определяли отдельно известными методами. [c.506]

Иная ситуация имеет место при проведении эксклюзионной хроматографии в водных средах. Из-за специфических особенностей многих разделяемых систем (белки, ферменты, полиэлектролиты и др.) и разнообразия применяемых сорбентов существует очень много вариаций состава подвижной фазы для подавления различных нежелательных эффектов [34, 35]. Общими приемами модификации является добавка различных солей и применение буферных растворов с определенным значением pH. В частности, поддержание рН=<4 дает возможность подавить слабую ионообменную активность силикагелей, обусловленную присутствием на их поверхности кислых силанольных групп. Требуемая ионная сила подвижной фазы достигается при концентрации буферного раствора 0,05-0,6 М оптимальную концентрацию подбирают экспериментально. Для предотвращения ионообменной сорбции катионных соединений наиболее часто используют такой активный модификатор, как тетраметиламмонийфосфат при рН=3. Однако при разделении некоторых белков могут проявляться гидрофобные взаимодействия, в свою очередь осложняющие эксклюзионный механизм разделения. Те же эффекты иногда проявляются и при работе с дезактивированными гидрофильными сорбентами. Для их устранения к растворителю добавляют метанол. Иногда в водную подвижную фазу вводят полярные органические растворители, полигликоли, кислоты, основания и поверхностно-активные вещества. [c.48]

К сорбентам для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии белков, ферментов и других биологических объектов предъявляются значительно более жесткие требования по инертности поверхности, чем к сорбентам для разделения синтетических полимеров. Кислые силанольные пруппы силикагеля обладают высокой адсорбционной активностью, проявляют слабые ионообменные свойства и способны денатурировать белковые молекулы. Поэтому поверхность жестких сорбентов очень тщательно модифицируют прививкой монослоев нейтральных гидрофильных органических групп. К таким сорбентам относятся ц-бондагель Е и материалы, содержащие глицерильные группы. Поверхность д-бондагеля Е модифицирована алифатически-ми эфирными группами. Колонки с этим сорбентом можно использовать с любыми растворителями от пентана до буферных растворов в области pH от 2 до 8. Они характеризуются высокой разрешающей способностью, но из-за малого рабочего объема (примерно 1,2 мл на колонку) требуется особо точная подача подвижной фазы. [c.108]

И. X. применяется для разделения катионов металлов, напр, смесей лантаноидов и актиноидов, 2г и НГ, Мо и W, КЬ и Та последние разделяют на анионитах в виде анионных хлоридных комплексов в р-рах соляной и плавиковой к-т. Щелочные металлы разделяют на катионитах в водных и водно-орг. средах, щел.-зем. и редкоземельные металлы-на катионитах в присут. комплексонов. Большое значение имеет автоматич. анализ смесей прир. аминокислот на тонкодисперсном сульфокатионите.в цитратном буфере при повыш. т-ре. Аминокислоты детектируют фотометрически после их р-ции с нингидрином или флюориметрически после дериватизации фталевым альдегидом. Высокоэффективная И. X. (колонки, упакованные сорбентом с размером зерен 5-10 мкм, давление для прокачивания элюента до 10 Па) смесей нуклеотидов, нуклеозидов, пуриновых и пиримидиновых оснований и их метаболитов в биол. жидкостях (плазма крови, моча, лимфа и др.) используется для диагностики заболеваний. Белки и нуклеиновые к-ты разделяют с помощью И. X. на гидрофильных высокопроницаемых ионитах на основе целлюлозы, декстранов, синтетич. полимеров, широкопористых силикагелей гидрофильность матрицы ионита уменьшает неспецифич. взаимод. биополимера с сорбентом. В препаративных масштабах И. х. используют для вьщеления индивидуальных РЗЭ, алкалоидов, антибиотиков, ферментов, для переработки продуктов ядерных превращений. [c.264]

С помощью Л. X, удается выделять и разделять соед., склонные к координации с ионами металлов, в присут. больших кол-в минер, солей и некоординирующихся в-в. Напр, с использованием иминодиацетатной смолы с ионами Си из морской воды выделяют своб. аминокислоты На катионитах с ионами Ре разделяют фенолы, с ионами Лg -сахара. На карбоксильных катионитах с N1 разделяют амины, азотсодержащие гетероциклы, алкалоиды. На силикагеле с нанесенным слоем силиката Си в водно-орг. среде в присут. ННз проводят быстрый анализ смесей аминокислот и пептидов, причем элюируемые из колонки комплексы легко детектируются спектрофотометрически. На высокопроницаемых декстрановых сорбентах с иминодиацетатными группами, удерживающими ионы N1 или Си- , селективно выделяются из сложных смесей индивидуальные белки и ферменты, содержащие иа пов-сти своих глобул остатки гистидина, лизина или цистеина. Силикагели с фиксированными на пов-сти инертными т/)ис-этилендиа.миновыми комплексами Со используют для т. наз. внешнесферной Л. х. смесей нуклеотид-фосфатов. Методом газовой Л. х. с помощью фаз, содержащих соли Ag , разделяют олефины, ароматич. соед., простые эфиры. Тонкослойная Л. х. на носителях, пропитанных солями Ag , применяется для анализа стероидов и липидов. [c.590]

Предложены разнообразные реакторы с иммобилизованными ферментами - колонки, убки, полые нити. Для заполнения колонок применяют ооьгчно ферменты, ковалентно связанные с аминированным стеклом, акриловыми полимерами, агарозой, сефарозой, найлонЬвым порошком, силикагелем и т. д. Один из лучших носителей для колоночных реакторов - сефароза, активированная бромци-аном. На ней успешно иммобилизовали и полиферментные системы. Так, для определения 2-20 мкМ триптофана анализируемую смесь пропускали через колонку, содержащую со- [c.79]

Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго — гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция. [c.89]

Куль и сотр. [356] и Мартинек и сотр. [356а] исследовали катализируемое ферментами образование пептидной связи в двухфазных водноорганических системах. Преимущество такой методики состоит в том, что функционирующая как катализатор протеаза не повреждается органическим растворителем, что гарантирует более высокие выходы, кроме того, можно вернуть обратно биокатализатор после разделения фаз. Далее Кй-нек и сотр. [386] впервые провели успешные пептидные синтезы с иммобилизованным химотрипсином. Наряду с иммобилизованными ферментами можно также использовать ферменты, адсорбционно фиксированные на силикагеле, что было продемонстрировано на примере синтеза пептидов с помощью химотрипсина, фиксированного на силикагеле [443]. [c.169]

Ферменты способны соединяться с поверхностью очень широкопористого силикагеля с образованием относительно устойчивого закрепленного на поверхности ферментного катализатора [282]. Широкопористый кремнезем с порами диаметром 51 нм использовался как носитель, к поверхности которого присоединялись молекулы фермента протеазы бактерии Ba illus subtili . Вначале происходила реакция бифункциональной соли диазония с поверхностью кремнезема, а затем реакция фермента с противоположной от поверхности группой диазония. Фермент на кремнеземном носителе был способен гидролизовать казеин его время полупревращения (время, за которое концентрация фермента уменьшалась вдвое) превышало 7 мес, тогда как точно такой же фермент, просто адсорбированный на исходном кремнеземе, имел время полупревращения всего 2,5 мес. [c.1061]

Впоследствии Крам и сотрудники синтезировали несколько оптически активных краун-соединений и провели расщепление различных хиральных первичных аммониевых солей и солей аминозфиров с использованием жидко-жидкофазной хроматографии. Кроме того, они осуществили расщепление на оптические изомеры с использованием жидкостной хроматографии на колонке, в которой оптически активные краун-эфиры были привиты к силикагелю [31, 39] или полистиролу [ 39], С упомянутыми работами связано также исследование, в котором был выполнен синтез моделей ферментов. Полученные модельные соединения использовались для проведения асимметрических реакций, Например, были синтезированы оптически активные краун-соединения, которые моделировали присущую ферментам связь с субстратом Эти соединения имеют дополнительные функциональные группы, присоединенные к ди-нафтильным группам. Таким образом, создаются новые центры связывания и достигается более избирательное связывание с "гостем". [c.282]

Гель-хроматография (гель-фильтрация, или ситовая хроматография) — метод разделения, очистки и анализа веществ, основанный на различии в размерах или массе молекул. В качестве стационарной фазы используют различные гели с трехмерной сетчатой структурой декстраны (полисахариды), полиакри ламиды, пористые силикагели, цеолиты и др. При разделении смеси небольшие молекулы диффундируют через поры набухшего в растворителе геля, а крупные молекулы проходят через пространство между частицами геля. При промывании геля растворителем в первую очередь перемещаются крупные молекулы, а затем уже мелкие, т. е. компоненты смеси элюируют в порядке уменьшения их молекулярной массы. Гель действует как молекулярное сито. Аппаратурная простота метода и мягкие условия разделения способствовали особенно широкому применению гель-хроматографии в биохимических исследованиях. Основное назначение гель-хроматографии — разделение высокомолекулярных веществ. С ее помощью выделены и очищены многие ферменты, пептидные гормоны, нуклеиновые кислоты. [c.498]

В работе с Николаевым [82], в которой мы исследовали действие носителя на фермент катализу, было найдено, что непосредственный контакт ферментных молекул друг с другом на сравнительно небольшой поверхности графита приводит к их дезактивации и что фермент наиболее активен в виде единично адсорбированных или свободных молекул в растворе, т. е. в виде единичного ансамбля. Аналогичную картину нашли Воробьева и Полторак [83, 84] в случае адсорбции гексогеназы на силикагеле. [c.39]

Приготовление вытяжек производилось по А. И. Ермакову [2] с некоторыми изменениями. Навески проростков пшеницы по 1 г растирались в фарфоровых ступках с водой и 0,2 г СаСОз, однородная масса количественно переносилась в мерные колбы емкостью 100 жл, и объем доводился водой до метки. Все вытяжки настаивались в Течение 3 часов и фильтровались через бумажные фильтры в стаканы. Затем в фильтрат вносилось по 1 г силикагеля и производилось перемешивание в течени 30 минут. При этом не ставилась задача полностью адсорбировать фермент из вытяжек, но [c.338]

Далее зерна силикагеля, несущие на себе фермент, помещались в каталазники,. где к силикагелю прибавлялись строго определенные концентрации 2,4-дихлорфенокси-уксусной или 2-метил-4-хлорфеноксиуксусной кислоты. Определение активности каталазы производилось газометрическим методом [2] при 20° С в каждом опыте расходовалось 5 мл 3%-ного раствора Н2О2. [c.339]

Среди других работ можно назвать работу [103], посвященную разделению двух ранее неизвестных желчных кислот из желчи крыс с применением хроматографии на целите в системе жидкость—жидкость, синтетическую работу [104] с применением окиси алюминия низкой активности, изучение метаболизма [105] с применением гидрофобного целита, а также работу [106], посвященную изучению строения стероидных кислот, выделенных из ephalosporium a remonim, и работу [107], посвященную омылению стероидных кислот под действием ферментов. В последних двух случаях применяли силикагель. [c.242]

Метод тонкослойно-хроматографического ингибирования ферментов был тщательно изучен [126] для группы пестицидов — производных карбаминовой кислоты. Проведено сравнение различных типов адсорбентов (кизельгель, силикагели разных марок, окись алюминия), систем растворителей, дана оценка чувствительности метода. В качестве ферментов были использова- [c.90]

В работе Олсона и др. [1] при разделении ферментов и антигенов аффинной хроматографией. применялись методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую отличают использование небольших колонок, высоких скоростей разделения, связанных с этим высоких давлений в системе и, что наиболее существенно, относительно небольших количеств анализируемых веществ. Носителем для иммобилизации аффинных лигандов служил силикагель, поскольку получаемые аффинные сорбенты на этом носителе могут работать в условиях высокого давления. Наиболее ярким примером эффективности такого метода служит разделение в течение 5 мин Н4 и М4 изозимов лактатдегидрогеназы на колонке с №-(6-аминогексил)-АМР—силикагелем в градиенте NADH. [c.452]

Рис. 6. Зависимость начальной скорости фосфоглюкомутазной реакция в условиях субстратного насыщения от концентрации ионов магния для фермента, адсорбированного на силикагеле, покрытом слоем холестерина (Полторак, Пряхин, Чухрай, 1976)

Методом гель-фильтрации исследовались также ферменты [238—240], красители [241, 242], глобулины [243, 244] и белки [245—248]. Отока [249] рассмотрел теоретические аспекты исследований молекулярно-массового распределения фракций полимеров на силикагеле. Общие сведения о гель-фильтрации можно найти также в работах Детермана [250], Виланда и Детермана [251] и Уильямса [252] . [c.163]

Кауфман и Вессельс [44] применили эффективный метод ферментативного расщепления. Согласно этому методу, анализируемые триглицериды подвергаются гидролизу под действием фермента поджелудочной железы, который расщепляет связи в положениях 1 и 3 и не действует на положение 2. Таким образом можно определить, представляет ли триглицеридная фракция один изомер или смесь изомеров. Смесь, полученную после ферментативного расщепления, хроматографируют на силикагеле с диизопропиловым эфиром, содержащим 1 % уксусной кислоты, и получают следующие три фракции исходные триглицериды, диглицериды и жирные кислоты, моноглицериды. Моноглицериды можно подвергнуть дальнейшему гидролизу и определить затем природу жирнокислотного компонента. Ладди и др. [59] также применили этот фермент для исследования образцов, взятых в количествах от 25 до 50 мкг, разделяя продукты реакции посредством тонкослойной хроматографии. [c.63]