Белки влияние pH на разделение

В то время как амины и аминокислоты, несущие положительный заряд, более прочно удерживаются при более высоких значениях pH, для отрицательно заряженных сорбатов справедливо обратное. Систематические исследования, проведенные на серии N-бензоил-о, L-аминокислот, позволили глубже понять механизм взаимодействия сорбата с белком. Влияние изменения свойств подвижной фазы на величины к VI а демонстрирует рис. 7.10. Во-первых, удерживание в значительной степени возрастает с усилением гидрофобного характера аминокислоты (Ser > А1а> Phe). Во-вторых, увеличение суммарного отрицательного заряда белка с увеличением pH вызывает уменьшение к для всех шести соединений (вследствие ионного взаимодействия). Далее, влияние концентрации буфера можно объяснить усилением адсорбции вследствие ионных взаимодействий при низкой ионной силе. Небольшое, но вполне заметное возрастание к для наиболее сильно удерживаемых сорбатов при высоких концентрациях буфера вероятнее всего является результатом усиления гидрофобных взаимодействий. Поскольку ионные (кулоновские) и гидрофобные взаимодействия по-разному подвержены влиянию ионной силы, то оба эффекта приводят к возникновению минимума в адсорбции сорбата (к ) в определенной точке. И наконец, совершенно очевидно влияние органического растворителя-модификатора он всегда приводит к понижению удерживания сорбата и тем сильнее, чем более гидрофобен сорбат. Влияние pH и ионной силы на удерживание незаряженных соединений невелико, но выражено вполне отчетливо. Оно связано исключительно с изменениями в связывающем центре ХНФ. Добавление пропанола-1 вызывает уменьшение удерживания по сравнению с наблюдаемым у заряженных сорбатов, что свидетельствует о преимущественном вкладе в удерживание гидрофобных взаимодействий. Это подтверждает также наблюдаемое очень большое влияние на удерживание длины цепи алканола-1. Высшие спирты являются значительно более эффективными конкурентами за связывающий центр, а потому вызывают более быстрое элюирование сорбата. Возможность регулирования удерживания путем изменения подвижной фазы, которую демонстрирует схема 7.6, говорит о том, что эту особенность данных хроматографических систем можно использовать в целях оптимизации разделения. [c.135]

Как и при разделении на ранее описанных полимерных ХНФ, механизм хирального распознавания в данной системе является сложным и до конца не выяснен. Однако основные причины удерживания сорбата были выявлены в ходе систематических исследований влияния его структуры и состава подвижной фазы на коэффициент емкости. Во многих отношениях альбумин-силикагелевый сорбент ведет себя подобно обращенно-фазовым материалам на основе алкилированного силикагеля. Спирты, преимущественно пропанол-1, помогают регулировать время удерживания, поскольку вызывают его быстрое уменьшение вследствие ослабления гидрофобных взаимодействий с сорбентом. Оптимизировать состав подвижной фазы можно, варьируя тремя основными параметрами, а именно pH, ионной силой и органическим растворителем-модификатором [90]. Вероятно, в любой хроматографической системе одновременно наблюдается влияние диполь-ионных и гидрофобных взаимодействий. Кроме того, возможно образование водородных связей и комплексов с переносом заряда. Большое влияние свойств подвижной фазы на значения к разделяемых энантиомеров можно объяснить зависимостью свойств белков от распределения заряда и его конформации. БСА состоит как минимум из 581 остатка аминокислот, связанных в единую цепь (мол. масса 6,6-10 ), и его надмолекулярная структура в значительной мере определяется присутствием в молекуле 17 дисульфидных мостиков. При рН7,0 полный заряд молекулы равен - 18, а изоэлектрическая точка равна 4,7. Как это хорошо известно из химии ферментов, смена растворителя способна вызывать изменения в структуре связывающего центра белка в результате изменения его заряда и конформации. [c.133]

B. С практической точки зрения важно отметить, что, повышая. напряжение при электрофорезе, можно работать с растворами низ--кой ионной силы. Это снизит теплообразование под влиянием электрического тока, но разделение белков будет не очень четким. При повышении ионной силы разделение проходит гораздо лучше. [c.50]

Чтобы полностью устранить влияние этого процесса на разделение белков, следует уложить смоченные буферным раствором полоски бумаги на рамку, поместить их в электрофоретическую камеру и закрыть крышку. Только после того как равновесие установится, т. е. примерно через 30 мин, можно наносить исследуемый образец. [c.52]

Препаративный электрофорез в крахмальном блоке. Принцип метода. Под влиянием электрического поля происходит миграция белков в крахмальном блоке, в результате которой белки разделяются, а после разделения их можно элюировать из крахмала. [c.83]

Возрастание ионной силы раствора без увеличения электропроводности среды, влияние на селективность при разделении белков [c.349]

Фракционирование белков на гидроксиапатите [23, 24] или геле фосфата кальция [25] является особой разновидностью ионообменной хроматографии. В этом случае разделение также основано на образовании электростатических связей между заряженными группировками молекул белков и ионами фосфата и кальция в кристаллах гидроксиапатита (ГА). Микрокристаллические частицы ГА состава Саю(Р04)б(0Н)2 или гель фосфата кальция фиксированы обычно на инертном носителе, например целлюлозе. ГА амфотерен, его изоэлектрическая точка сильно зависит от метода получения она может находиться в диапазоне от 6,5 до 10,2. На прочность связывания положительно заряженных группировок оказывают сильное влияние неорганические соли прочность связывания отрицательно заряженных групп практически не зависит от концентрации солей. Кроме того, сорбция в присутствии солей зависит и от молекулярной массы белка. Различные аспекты применения ГА для [c.437]

Значительное внимание уделялось исследованию возможных способов расположения пептидных цепей, приводящих к устойчивым конформациям. В 1958 г. Л. Полинг показал, что наиболее выгодным расположением, которое осуществляется во многих пептидах и белках, является а-спираль. Пептидные цепи а-спирали свернуты таким образом, что возможно образование водородных связей между амидными водородными атомами и карбонильными группами, разделенными четырьмя аминокислотными фрагментами (рис. 80). Водородные связи почти параллельны основной оси спирали, а расстояние между витками составляет около 5,5 А. Боковые цепи аминокислот лежат на внешней стороне а-спирали. Однако пространственные затруднения, возникающие между боковыми группами некоторых аминокислот, могут существенно деформировать нормальную а-спираль и вызвать изгиб цепи. Наиболее существенно в этом отношении влияние пролина и оксипролина. [c.386]

Если проводить электрофорез в порах какого-либо твердого материала, гравитационная стабильность уже не играет существенной роли. Отпадают многие трудности, связанные с введением образца и тепловой конвекцией. Но возникают специфические проблемы возможность адсорбции исследуемого вещества на поверхности раздела фаз, электроосмотическое движение жидкости в порах, влияние неоднородности поддерживающей среды и т. д. Несмотря на это, именно электрофорез на твердом носителе нашел наиболее широкое распространение в лабораторной и клинической практике благодаря простоте аппаратуры, быстроте и хорошему качеству разделения, применимости к самым различным классам веществ, ионизованных в водных растворах, начиная от белков и нуклеиновых кислот и кончая неорганическими ионами. [c.80]

Способы получения. Гидролиз белков под влиянием ферментов, кислот или щелочей. Этим способом можно получить любую из 22 кислот, входящих в состав белков. Однако разделение образовавшейся при гидролизе смеси амирюкислот представляет собой трудную задачу. [c.182]

Недавно было показано, что нуклеопротеиды [147] и другие белки [148], разделенные с помощью гель-электрофореза, можно перенести на нитроцеллюлозные или диазобензилоксиметилцел-люлозные фильтры. Более того, белки после такой процедуры сохраняют способность связываться с ДНК [148]. С помощью этого метода, по-видимому, можно выделить и охарактеризовать белки, взаимодействующие с ДНК или РНК. В работе [149] показано, что /ас-репрессор из Е. соИ специфически удерживается на колонке с диазобензилоксиметилцеллюлозой, содержащей ковалентно связанные фрагменты /ас-оператора Е. соН. В отличие от электрофоретического разделения, которое требует соблюдения весьма специфических условий, этот тип аффинной хроматографии идеально подходит для изучения влияния ионной силы, pH и температуры на эффективность взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Такого рода аффинную хроматографию, вероятно, можно использовать для очистки белков, контролирующих экспрессию генов. [c.196]

В предыдущем разделе было отмечено, что степень сшивания оказывает решающее влияние на процесс разделения веществ на ионитах. Так, на дауэксе 50x8 или х16 можио разделить аминокислоты, тогда как высшие Пептиды и белки проходят через такую колонку без задержки Высшие Пептиды (но не высокомолекулярные белки) разделяются удовлетвори- [c.549]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

С помощью кварцевого капилляра с внутренним диаметром 50-100 мкм удалось достигнуть высокоэффективного разделения белков и дансил-аминокислот, при котором из-за сравнительно большого отношения поверхности к объему было сильно уменьшено влияние мешающей разделению термически индуцированной конвекции. Применение кварцевого капилляра позволило использовать модифицированный ВЭЖХ-детектор для определения разделяемых веществ непосредственно в капилляре. Простота аппаратуры и возросшая потребность в разделении биомолекул привели во второй половине 80-х годов к повышенному интересу к данному методу. [c.7]

Хроматография — наиболее часто используемый аналитический метод. Новейшими оматографическими методами можно опрвд шпъ газообразные, жидкие и твердые вещества с молекулярной массой от единиц до 10 . Это могут быть изотопы водорода, ионы металлов, сингетические полимеры, белки и др. С помощью хроматографии получена обширная информация о строении и свойствах органических соединений многих классов. Применение хроматографических методов для разделения белков оказало огромное влияние на развитие современной биохимии. Хроматографию с успехом применяют в исследовательских и клинических целях в самых разных областях биологии и медицины, в фармацевтике и криминалистике дпя терапевтического мониторинга в связи с ростом нелегального употребления наркотиков, идентификации антибиотиков и отнесения их к той или иной группе антибактериальных препаратов, дпя определения наиболее важных классов пестицидов и дпя мониторинга окружающей среды. Такие достоинства как универсальность, экспрессность и чувствительность делают хроматографию важнейшим аналитическим методом. Более десяти работ (1957—1980), выполненных с применением хроматографических методов, были удостоены Нобелевских премий среди авторов методических работ, удостоенных премий, А. Тизелиус (1948), А. Мартин и Р. Синдж (1956). [c.265]

Выше отмечалось, что, начиная с Хаггинса, огромную роль в стабилизации пространственной формы белковой цепи стали отводить пептидным водородным связям. Считалось, что именно они формируют вторичные структуры - а-спираль и р-складчатые листы. Но что в таком случае удерживает эти структуры в глобуле и под влиянием каких сил белковая цепь свертывается в нативную конформацию в водной среде, где пептидные водородные связи N-H...O= и электростатические взаимодействия малоэффективны Можно поставить вопрос иначе. Почему внутримолекулярные взаимодействия у природной гетерогенной аминокислотной последовательности превалируют в водном окружении над ее взаимодействиями с молекулами воды Фундаментальное значение в структурной организации белковой глобулы стали отводить так называемым гидрофобным взаимодействиям. Само понятие возникло в начальный период изучения коллоидного состояния высокомолекулярных веществ, в том числе белков. Первая теория явления, правда, не раскрывающая его сути, предложена, в 1916 г. И. Ленгмюром. Ему же принадлежит сам термин и разделение веществ на гидрофобные, гидрофильные и дифиль-ные. Природа гидрофобных взаимодействий была объяснена У. Козманом (1959 г.). Он показал, что низкое сродство углеводородов и углеводородных атомных групп к водному окружению обусловлено не неблагоприятными с энергетической точки зрения межмолекулярными контактами, а понижением энтропии. На энтропийный фактор обращали внимание еще в 1930-е годы для объяснения причин образования мицелл моющих средств в водных коллоидных растворах (Дж. Батлер, Г. Франк, Дж. Эдзал), однако такая трактовка формирования компактных структур не была перенесена на белки. Впервые это сделал Козман, поэтому гидрофобная концепция носит его имя. [c.73]

В настоящее время установлено, что многие нативные белки устойчивы к действию различных реагентов, что можно объяснить только мощным взаимодействием различных групп в одной и той же пептидной цепи или взаимодействием полипептидных цепей разных молекул. Влияние водородной связи на повышение стабильности может быть значительным [187], и для разделения двух неполярных боковых цепей в водном растворе требуется больше энергии, чем это следует из расчета вандерваальсовых сил. Это можно отнести за счет энергии, необходимой для разделения молекул воды, удерживаемых вместе водородными связями, которые разрываются во время установления равновесия между неполярными группами и водой [174, 175]. Взаимодействия между небольшими молекулами и белками [182] и между белковыми молекулами [335] рассмотрены в недавно опубликованном обзоре и могут быть проиллюстрированы на примере поведения инсулина в растворе. [c.176]

В целом же удерживание в данном случае определяется тем же типом взаимодействий, что и на альбумин-силикагелевой ХНФ, и здесь применимы в основном те же приемы регулирования удерживания и селективности, но в качестве спиртового модификатора более предпочтителен пропанол-2 [96]. В качестве модификаторов были также испытаны как катионные, так и анионные соединения. Анализ их влияния на удерживание ионных соединений показал, что оно хорошо описывается моделью ион-парных равновесий для взаимодействия сорбат-сорбент [97]. Таким образом, при разделении оптических изомеров на колонках Епап11оРас можно пользоваться теми же приемами, которые широко используются в обращенно-фазовой хроматографии [98]. Это еще раз подчеркивает важность гидрофобных связывающих центров для ХНФ на основе белков. [c.138]

Нативный раствор, содержащий бензилпенициллин, из сборника (1) поступает на первую экстракцию бутилацетатом Экстракция —массообменный процесс, и он прот екает тем быстрее, чем ин -тенсивнее входят в соприкосновение друг с другом несмешиваю-щиеся жидкости Поэтому очень важно провести эмульгирование (3), н6 при этом эмульсия должна хорошо разделяться в сепараторе (6) В связи с тем, что нативный раствор содержит большое количество поверхностно-активных веществ белковой природы, в процессе экстракции образуются весьма стойкие трудноразделяемые эмульсий Это требует применения специальных дезэмульгаторов, например, поверхностно-активное вещество — авироль Действие авироля основано на том, что он вытесняет белковые вещества из межфазовой поверхности, образуя пленку на границе раздела фаз (между водой и бутилацетатом) Пленки, образованные ПАВ, обладают незначительной прочностью по сравнению с пленками из белка, поэтому эмульсии легко разрушаются под влиянием центробежных сил, развиваемых в сепараторах Для разделения эмульсий достаточно добавить к нативному раствору 0,05—0,1% ПАВ [c.337]

ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПОЛИМЕРЫ, вращают плоскость поляризации света, проходящего через нх р-ры, расплавы и прозрачные стекла. Оптич. активность полимера м. 6. обусловлена хиральностью элементарных звеньев или спиральной конформацией цепи. Вклад спиральных структур в суммарную оптич. активность может достигать значит, величин (напр., у белков и полиаминокислот), однако он сильно меняется с изменением конформации цепи. О. а. п. отличаются от аналогичных неактивных полимеров гидродинамич. св-вами р ров (напр., зависимостью вязкости от мол. массы) и т-рой стеклования. Получ. полимеризация или поликонденсация оптически активных мономеров хим. модификация полимера оптически активным в-вом сте-реоселектиБная полимеризация рацемич. мономеров асимметрич. стереоспецифич. полимеризация или сополимеризация олефинов либо замешенных диенов полимераналогичные превращения О. а. п. Синтезируют О. а. п. с целью изучения влияния стереорегулярности цепи на ее конформацию по сохранению асимметрич. центров в элементарном звене судят о механизме полимеризации. Сшитые О. а. п., напр. ионооб]менные смолы, использ. для хроматографич. разделения энантиомеров. О. а. п. можно использовать для получ. поляроидов. [c.412]

Метод противоточного распределения, разработанный Крейгом [36], был применен для разделения смесей аминокислот и очистки белков [187]. Так как полярные группы, определяющие растворимость аминокислот, одинаковы для различных аминокислот, коэффициенты распределения аминокислот различаются незначительно, и, следовательно, их разделение становится трудной задачей. При ацетилировании [172] или образовании нипсиль-ных производных (/г-иодфенилсульфонилпроизводные) [94] фракционирование облегчается за счет уменьшения влияния полярных групп. Хроматографические методы значительно более эффективны по разрешающей способности, но они ограничены возможностью выделений сравнительно небольших количеств веществ. Успешное применение метода противоточного распределения зависит в значительной степени от подходящего выбора двухфазной системы растворителей. Кроме того, применение этого метода ограничивается возможностью разделения веществ низкого молекулярного веса 10 ООО), за исключением тех случаев, когда пептиды обладают большой устойчивостью к денатураций. В присутствии большинства двухфазных систем растворителей, как правило, легко происходит денатурация белков. Однако при нахождении благоприятных условий противоточное распределение-имеет преимущество по сравнению с другими методами, так как при этом возможно рассчитать коэффициенты распределения компонентов, которые могут быть установлены с большой точностью. Профиль кривой распределения дает хороший критерий чистоты вещества. [c.397]

Вопросам фракционирования белков, в частности ферментов, а также методам приготовления геля фосфата кальция на целлюлозе посвящен обзор [27]. Механизм разделения на ГА еще не выяснен до конца, что связано, по-видимому, со сложным поли-функцнональным характером взаимодействия белка с амфотер-ным носителем, а также недостатком данных относительно влияния молекулярного веса белка на процесс разделения. Возможно, этим объясняется тот факт, что хроматография на ГА еще не получила должного признания. [c.451]

Сыворотку инкубируют в стандартных условиях с меченым гормоном, а затем хроматографируют. При этом получают три пика радиоактивности пик связанного с белком гормона, пик свободного гормона, а между ними пик свободного 12 , образовавшегося при фотохимическом разложении гормона. Результаты количественного определения отлично совпадают с данными, полученными другими методами эти результаты были подтверждены на многих сотнях случаев [113, 114]. Многократно было описано также разделение иодированных аминокислот, продуктов их ассоциации с белками и неорганического иода (см. литературу к гл. IV, приложение II). Этот прием использовался для количественного определения 1 -тиро-нина и I -тироксина [115—117]. Для определения немеченого тироксина сыворотку вначале депротеини-зируют, а затем прибавляют определенное количество тироксинсвязывающей фракции глобулинов. Потом инкубируют с определенным количеством меченого тироксина и определяют распределение активности на сефадексе G-25. Таким путем можно оценить количество первоначально присутствовавшего в среде тироксина, поскольку он конкурирует с радиоактивным гормоном за связывание с глобулином [118]. В настоящее время разработан метод разделения и определения гормонов щитовидной железы, позволяющий обнаруживать количества порядка одного нанограмма [119]. С другой стороны, высказано критическое мнение, что следует очень тщательно учитывать спонтанную деградацию тироксина, влияние размеров колонки и необратимую адсорбцию тироксина [120]. [c.227]

Аналогичные работы по разделению белков пенным методом проводила и другая группа исследователей [41]. Эти исследователи провели ряд опытов с уреазой растения Сапа аНа епз Гогт 5 для выявления влияния pH среды и концентрации белка, а также диспергирующей эффективности аппаратуры на концентрирование одного из компонентов смеси белков (в данном случае уреазы) в пене. Как и в предыдущих исследованиях [63], было установлено существование оптимального значения,рН вспениваемой среды. При различных концентрациях белка этот оптимум оказался близким к изозлектрической точке уреазы. В противоположность предыдущим данным [63], когда было обнаружено, что степень обогащения возрастает с уменьшением концентрации, изучение влияния концентрации [c.109]

Влияние стабильности пены на эффективность пенного разделения доказывается тем, что максимальное концентрирование белка бычьей сыворотки в пене достигается в изозлектрической точке, т. е. при значении pH, при котором белок обладает максимальной поверхностной активностью. С увеличением или снижением pH степень концентрирования падает [63]. [c.136]

Из уравнения (17) следует, что с уменьшением величины ёр снижается и высота теоретической тарелки, т. е. чем меньше диаметр частиц, тем выше разрешение (более узкие зоны). Однако на практике нецелесообразно использовать слишком мелкие гранулы, поскольку в этом случае скорость потока падает, а время эксперимента соответственно растет. Кроме того, как следует из уравнения (16), в случае падения скорости потока начинает сказываться отрицательное влияние диффузии (которой соответствует первый член в правой части уравнения), имеющей тенденцию увеличить высоту теоретической тарелки. Что касается разделения белков, то нет оснований считать, что частицы геля слишком малы, поскольку, как показали многочисленные эксперименты, скорость элюирования является вполне удовлетворительной. При фракционировании высокомолекулярных белков иногда предпочтительно использовать вместо декстрана н [c.249]

При таком двумерном разделении фракция сывороточных белков дает не менее 12 зон. Их расположение на пластинке указывает на то, что при проведении электрофореза эффект молекулярных сит фактически отсутствует. Аномальная миграция при электрофорезе наблюдается лишь в случае а-макроглобу-лина, что может быть обусловлено тормозящим влиянием сетки геля. Вергани и сотр. [25] модифицировали методику путем проведения электрофореза на мембранах из ацетата целлюлозы. Таким способом удалось избежать тормозящего влияния геля на г-макроглобулин и другие высокомолекулярные белки. [c.269]

Крыс обучали менять лапу при доставании пищи и затем изучали влияние этого обучения на выделенных нервных клетках контрольного участка гиппокампа. Не принималось никаких хирургических мер для того, чтобы пробудить животное заменять предпочитаемую лапу другой при доставании пищи, находящейся на дне длинной и узкой стеклянной трубки (рядом с трубкой и параллельно ей ставили стенку). Поскольку животное из-за конструкции трубки не может достать пищу предпочитаемой лапой, оно старается сделать это другой лапой и в конце концов обучается. В день крысе дают два урока. На четвертый— пятый день обучения крысы находятся еще на восходящей ветви кривой обучения. Затем из мозга крыс этого периода обучения выделяют участок гиппокампа САЗ, содержащий парамидные клетки (средние). За полтора часа до этого крысам в оба боковые желудочка мозга вводят Н-лейцин (60 X 2 мкл с радиоактивностью 1 мкКи/мкл). Берут образцы нервных клеток из участков САЗ гиппокампа, гомогенизуют и экстрагируют для солюбилизации белков солевым раствором, содержащим Тритон Х-100, как это было описано в разд 7.1.3. При разделении белков на микрогеле получаются 2 основные белковые фракции в кислой половине геля (рис. 3 Л). [c.294]