Промежуточные соединения в ферментативных реакциях

В качестве критериев, доказывающих, что данное фермент-субстратное соединение является ковалентным промежуточным соединением ферментативной реакции, мо кно выдвинуть следующие [c.44]

Как отмечалось в гл. 7, выявление промежуточных соединений ферментативных реакций потребовало больших усилий. Было установлено, что в физиологических условиях в ходе реакций с участием многих наиболее распространенных гидролитических ферментов и природных субстратов эти соединения не накапливаются (табл. 10.5), в связи с чем механизм действия пепсина и карбоксипептидазы до сих пор не удалось установить. [c.325]

Превращение субстрата под действием фермента проходит обычно через ряд короткоживущих промежуточных соединений, изучение реакционной способности которых помогает выяснить механизм ферментативного катализа. К настоящему времени рав работаны такие методы, которые позволяют определять значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативных реакций при изучении кинетики их протекания в стационарном режиме (см. гл. 7). Однако наиболее прямую и надежную информацию о кинетике промежуточных стадий можно получить, изучая ферментативные реакции в нестационарном режиме их протекания (с применением методов изучения быстрых реакций в растворах). [c.186]

Как видно из разд. 7.1, суть большинства химических реакций, протекающих в биологических системах, заключается в окислении или восстановлении одного или более реагентов. Однако особенно важный тип реакций, к которому, очевидно, относятся многие ферментативные реакции, не связанные с окислением — восстановлением,— это реакции, включающие перенос протона и сопровождающиеся общим основным или кислотным катализом. Естественно, многие из этих ферментативных превращений осуществляются с помощью небелковых кофакторов или коферментов. К таким коферментам относятся некоторые серосодержащие коферменты, среди которых тиаминпирофосфат (часто называемый витамином В1) имеет наибольшее значение. Сейчас уже очевидно, что механизм действия тиаминпирофосфата включает участие карбаниона в качестве промежуточного соединения. Правда, некоторые особенности этого процесса еще недостаточно изучены. [c.458]

Исследования кинетики ферментативных реакций в стационарном режиме — один из наиболее распространенных способов изучения механизма действия ферментов. Это определяется рядом особенностей ферментативных реакций и прежде всего тем, что для ферментативных реакций стационарное состояние устанавливается весьма быстро. Для простейшей схемы ферментативного процесса с участием одного промежуточного соединения (схема Михаэлиса — Ментен) [c.171]

Для реакций, протекающих по более сложным механизмам (по сравнению с механизмом Михаэлиса—Ментен), стационарное состояние существует лишь при некоторых дополнительных условиях, определяемых соотношением констант скоростей индивидуальных стадий. Так, например, для обратимой ферментативной реакции с участием одного промежуточного соединения [c.173]

Однако для многих ферментативных реакций условие стационарности может выполняться приближенно. Для этого достаточно, чтобы абсолютные значения производных по времени для концентраций промежуточных соединений были одновременно малы (но не обязательно равны нулю) по сравнению с абсолютными значениями производных концентраций субстрата и продукта, т. е. [c.174]

С другой стороны изучение ферментативных реакций в стационарном режиме имеет ряд существенных недостатков. Наиболее важным из них является то, что стационарная кинетика дает весьма ограниченную информацию о детальном кинетическом механизме ферментативной реакции. Стационарная кинетика, отражая лишь лимитирующие стадии процесса, практически не дает информации о быстрых , нелимитирующих стадиях превращения субстрата в активном центре фермента. Определение элементарных констант скорости многостадийной ферментативной реакции из данных стационарной кинетики не представ-ляется.возможным. Действительно, кинетика каталитической реакции, включающей п промежуточных соединений (схема 5.16), описывается 2 п + 1) константами скорости. Стационарная же скорость этой обратимой реакции независимо от числа промежуточных соединений, принимающих участие в механизме реакции, дается уравнением (см. гл. VI) [c.174]

Более детальную информацию о механизме ферментативной реакции с участием ряда промежуточных соединений дает изучение процесса в нестационарном режиме. Именно поэтому теоретические и экспериментальные методы исследования нестационарной кинетики ферментативных реакций получили в последнее время существенное развитие. [c.175]

Кинетические закономерности ферментативных реакций с участием двух промежуточных соединений. Кинетика трехстадийной реакции с равновесной первой стадией. Детальный кинетический анализ действия ряда ферментов обнаруживает участие в механизме катализа по крайней мере двух промежуточных соединений. [c.190]

Предстационарная кинетика ферментативной реакции с участием промежуточных соединений. Формально-кинетический анализ кинетики каталитических реакций с участием промежуточных соединений может быть проведен и в обш,ем виде — для реакции с участием произвольного числа п промежуточных соединений [22]. [c.201]

При анализе механизмов ферментативных реакций наибольшее применение нашел метод температурного скачка. Это объясняется тем, что разработана достаточно простая и надежная аппаратура, позволяющая осуществить изменение температуры за несколько микросекунд, а также тем, что данный метод позволяет работать с небольшим объемом исследуемого раствора (до 0,1 мл), что весьма важно при исследовании реакций с ферментами. Метод температурного скачка использует чувствительную спектрофотометрическую аппаратуру и, следовательно, можно регистрировать весьма незначительные концентрации промежуточных соединений [39, 41, 42]. Принципиальная схема установки температурный скачок приведена на рис. 71. Обычно температурный скачок осуществляется за счет разряда высоковольтного конденсатора через раствор электролита в реакционной ячейке. [c.213]

Рассмотрим общую схему ферментативной реакции, включающей образование п промежуточных соединений [c.186]

Крахмал (СбН дОд),, — один из самых распространенных полисахаридов. Встречается практически во всех растениях, выполняя роль запасного питательного продукта. Продуктом полного гидролиза крахмала яляется а-/)-глюкоза. При кислотном и ферментативном гидролизе крахмал расщепляется на ряд промежуточных соединений, состоящих из меньшего числа глюкозных остатков. Характерной реакцией на крахмал является его взаимодействие с иодом, сопровождающееся образованием окрашенного в синий цвет продукта реакции. Эту реакцию часто используют для контроля хода гидролиза крахмала. По мере распада молекулы крахмала и образования продуктов с меньшей относительной молекулярной массой синяя окраска постепенно переходит в красную и затем, когда реакция гидролиза заканчивается, раствор полностью обесцвечивается [c.398]

Существенным моментом, определяющим скорость ферментативной реакции, является концентрация реагирующих веществ, учитывая тем более, что фермент предварительно образует промежуточное соединение с субстратом. Это предположение впервые было высказано В. Анри в 1902 г., а затем в 1913 развито и обосновано Л. Михаэлисом и его сотрудницей М. Ментен. [c.130]

Для реакций, проходящих с участием коферментов, почти в любом случае можно предложить механизмы, опирающиеся на рабочие модельные системы В отличие от этого ни для одной реакции, катализируемой чистым ферментом, детального механизма не сформулировано. Предметом исследования механизма органической реакции является установление всех ее промежуточных стадий— как переходных состояний, так и интермедиатов—с такими подробностями, которые нам известны для стабильных начальных соединений и продуктов. В настоящее время мы не можем ни для одной ферментативной реакции надежно идентифицировать все промежуточные состояния. [c.456]

Иванов и Карпейский считают многоточечное связывание причиной стабилизации активной электронной конфигурации, термодинамически невыгодной в гомогенном растворе, и причиной надлежащей ориентации реагирующих групп. Существование в активном центре по крайней мере двух пространственно различных структур (в случае ААТ двух различных ориентаций коферментного цикла) обеспечивает выполнение указанных условий в многостадийной ферментативной реакции. Условия оптимальности каждой последовательной стадии обеспечиваются структурной перестройкой, происходящей в предыдущей стадии. На языке термодинамики изложенное означает, что в активном центре происходит выравнивание уровней свободной энергии промежуточных соединений. В случае ААТ этот эффект проявляется в спектре поглощения ФСК (рис. 6.17), содержащем полосы поглощения практически всех [c.381]

В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода вытеснения профлавина . Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-химотрипсином в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна -концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа остановленной струи , вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции. [c.188]

В биокинетике достаточно часто возникает задача определения числа экспонент, которые могли бы наилучшим образом описать экспериментальные данные, а также определения параметров этих экспонент. Такая постановка задачи неслучайна и связана с тем, что исходя из теоретических исследований большинство биокинетических зависимостей должно описываться экспонентой или суммой экспонент. Так, в предыдущих главах было показано, что число экспонент соответствует числу промежуточных соединений в реакциях образования продуктов ферментативной реакции, числу камер в фармакокинетических моделях и т.д. [c.695]

В. Дис-ендиольное промежуточное соединение в реакциях ферментативной изомеризации альдоз в кетозы [c.106]

В разных случаях гидролиз амидной связи может также ускоряться. В приведенном ниже примере каталитический эффект оказывает пиридиновое кольцо. Первая скоростьлимитирующая стадия (медленная) приводит к образованию промежуточного ацилпиридиния(1-11), напоминающего ацильиое производное фермента, обнаруживаемого во многих ферментативных реакциях. Это промежуточное соединение затем быстро гидролизуется водой. [c.18]

В связи с этим главный вопрос относительно предполагаемого ферментативного механизма действия карбоксипептидазы А состоит в стерической возможности и способности карбоксильной группы 01и-270 эффективно участвовать в нуклеофильной реакции. Фактически доказательство ее участия сейчас уже получено в спектроскопических исследованиях при температурах <0°С (—60°С) ковалентного ацилферментного промежуточного соединения, полученного при гидролизе субстрата О-(гранс-л-хлорциннамоил)-г-Р-фениллактата карбоксипептидазой А [224]. Более того, результаты свидетельствуют о том, что деацилирование промежуточного смешанного ангидрида катализируется связанной с цинком гидроксильной группой. [c.351]

Нерешен также и вопрос о ковалентном катализе. В ряде ферментативных реакций образуются промежуточные соединения с ковалентной связью между ферментом и субстратом [29, 48, 49]. В качестве примера можно указать на протеазы, где в ходе ферментативной реакции образуется ацилфермент (см. гл. IV). Трудно сказать, почему реакция не протекает прямо, а идет через образование промежуточного соединения с ферментом (или коферментом). В этом отношении Дженкс [29] указал, что именно здесь могут быть заложены важные химические закономерности ферментативного катализа, которые в настоящее время почти или вообще не поняты . Не исключено, однако, что причина простая, а именно, что в ковалентно-связанном промежуточном соединении легче, чем в сорбционном фермент-субстратном комплексе, реализуются различного рода механизмы напряжения, которые позволяют использовать свободную энергию сорбции химически инертных субстратных фрагментов на ферменте на понижение активационного барьера скоростьлимитирующей химической стадии (см. 4 этой главы). Возможно, наличие промежуточных соединений в ферментативных механизмах отражает лишь сложную картину участия в реакции большого числа функциональных групп, многие из которых вообще склонны образовывать ме-тастабильные продукты (как, например, имидазольная группа [29]). Иными словами, образование промежуточных соединений хотя и сопровождает ферментативный катализ, но, возможно, не имеет прямого отношения к наблюдаемым ускорениям. [c.66]

Исследование ферментативных реакций в предстационарном режиме нуждается в специальной экспериментальной технике, поскольку используемые методы должны иметь достаточно высокую временную разрешающую способность. Мертвое время экспериментальной методики должно быть существенно меньше времени протекания реакции в предстационарном режиме. В качестве примера рассмотрим случай реакции с участием одного промежуточного соединения. Экспериментальную методику можно считать удовлетворительной, если ее мертвое время будет меньше величины т [см. уравнение (5.109)]. Используя наиболее характерные для ферментативного катализа значения констант скоростей, можно оценить величину т. Величина константы скорости образования фермент-субстратного комплекса ( 1) для большинства ферментативных реакций лежит в диапазоне 10 —10 М" X Хс (см. гл. VII). Типичное значение Кт, характерное для многих ферментативных реакций, равно 10 М. Если положить минимальную концентрацию субстрата равной 10" М (эту концентрацию еще можно определить чувствительным спектрофотометрическим методом), зна-чениет будет лежать в диапазоне 10 —10" с. Это показывает, что для исследования предстационарной кинетики ферментативных реакций необходима специальная экспериментальная техника, позволяющая регистрировать кинетические процессы в микро- и миллисекундном временном диапазоне. [c.204]

Основная идея о принципах биокатализа возникла еще в начале нащего века благодаря трудам Брауна и Анри и позднее была развита Михаэлисом и Ментен, а также Бриггсом и Холденом. Идея заключается в том, что механизм каталитического действия ферментов состоит в общем случае в образовании между ферментом и субстратом промежуточных соединении, претерпевающих в ходе реакции последовательные превращения вплоть до образования конечных продуктов и регенерации фермента. Действительно, в простейшем случае описание кинетики ферментативной реакции укладывается в рамки так называемой двухстадийной схемы [c.216]

Обрабатывая экспериментальные данные (табл. 19) обычным способом, находим, что величина ккяг зависит от состояния двух ионогенных групп фермент-субстратного промежуточного соединения с р/С а = 6,7 и рК ь — , и ккат/Кт(нат) зависит от состояния одной ионогенной группы свободного фермента с рКа=7,. Для данной ферментативной реакции стадией, лимитирующей скорость гидролиза, является ацилирование (йг С з), поэтому фор- [c.241]

Действие фермента основано на сочетании концентрационного, ориентационного и нолифункционального эффектов. Первый из них дает примерно тысячекратное ускорение, второй (определенная ориентация молекул ферментами) — примерно такое же, но решающее значение имеет третий каталитический эффект — одновременное воздействие на молекулу вещества нескольких атакующих групп фермента или серии последовательных атак на превращающуюся химическую связь, т. е. согласованное взаимодействие нескольких реагирующих групп (полифункциональный катализ, как правило, не типичен для обычных химических реакций). Ускорению процессов способствуют и другие факторы, в частности искажение некоторых частей молекулы вещества, испытывающего превращение под влиянием фермента. При ферментативном катализе также образуются промежуточные соединения. [c.160]

Итак, представления о карбокатионном промежуточном соединении (или переходном состоянии) в катализе лизоцимом достаточно обоснованы (в том числе и теоретически, см. [95, 96, 106, 112— 114]). Тем ие менее неясными остаются вопросы о роли остатка Asp 52 в катализе и о дальнейшей судьбе промежуточного карбоксониевого иона в катализе лизоцимом. Возможные гипотезы иа этот счет рассматриваются при обсуждении альтернативных механизмов ферментативного катализа. Наиболее приемлема, по-видимому, гипотеза об образовании промежуточного карбокатиона (который может представлять собой или переходное состояние реакции, или короткоживущее промежуточное соединение) и последующей быстрой рекомбинации его с отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка Asp 52. Ковалентный гликозил-фермент (ацилаль) далее атакуется водой или внещним нуклеофильным агентом (акцептором) с образованием соответствующего продукта и возвращением фермента к прежнему активному состоянию. Эта гипотеза даст положительный и определенный ответ на оба поставленных выше вопроса — о роли остатка Asp 52 и дальнейи1ей судьбе карбоксониевого иона в катализе лизоцимом. [c.176]

Поскольку два соединения, получающиеся при замене Н на 2 (46 и 47), не идентичны, а энантиомерны, атомы водорода в исходной молекуле неэквивалентны. Такие атомы или группы, дающие при замещении третьей группой энантиомеры, называют энантиотопными. В симметричном окружении такие два атома водорода ведут себя как эквивалентные, но в несимметричном окружении они могут вести себя по-разному. Например, при взаимодействии с хиральным реагентом они могут подвергаться атаке с различной скоростью. Это имеет важнейшее значение в ферментативных реакциях [127], так как ферменты способны к гораздо большей степени дифференциации, чем обычные хиральные реагенты. Примером служит цикл Кребса в биологических объектах, где щавелевоуксусная кислота (48) превращается в а-оксоглутаровую кислоту (50) через последовательность превращений, включаюш,их промежуточное образование лимонной кислоты (49). При проведении процесса с ща- [c.172]

Этаналь (ацетальдегид, уксусный альдегид) СН3СНО — душистая нейтральная жидкость с т. кип. 21 °С, получаемая в промышленности при гидратации этилена (разд. 3.4.3, А). В живых организмах является промежуточным соединением при ферментативном окислении этанола или в процессе спиртового расщепления глюкозы. Ацетальдегид обладает всеми обычными реакциями типичного альдегида, окисляется гипогалогенитами натрия до галоформов (например, хлороформа). Циклический тример, паральдегид (разд. 7.1.4, Б), используется как успокаивающее средство. [c.135]

Анализ обменных реакций в качестве критерия механизма часто используется при изучении сложных ферментативных процессов во всех областях метаболизма, и поэтому его надо хорошо понять. Вместе с тем необходимо отдавать себе отчет в возможных ограничениях применимости этого критерия. Механизм двойного замещения предсказывает наличие определенных обменных реакций, однако экспериментальное обнаружение этих обменных процессов еще не доказывает существования промежуточных соединений, содержащих ковалентно связанный фермент. Более того, ферменты, использующие механизм двойного замещения, не во всех случаях катализируют ожидаемые обменные раак-ции (разд. В, 5). [c.97]

На рис. 11-3 некоторые бнолотнчески активные соединения расположены по мере возрастания степени окисленности углерода. Видно, что больщинство биологически важных промежуточных соединений отли-чается по степени окисленности от углеводов всего лищь на 2 электрона, причем ло мере удлинения цепи это различие (Имеет даже тенденцию К уменьщению. Исключительно трудно перемещаться при помощи ферментативных процессов между соединениям , содержащими 2, 3 и 4 атома углерода (т. е. в вертикальном направлении на рис. 11-3), если только они не находятся на уровне окисленности углеводов или соединений, расположенных правее, на несколько более высоком уровне окисленности. В то же время часто бывает возможно перемещаться по горизонтали, с легкостью используя окислительно-восстановительные реакции. Например, жирные кислоты собираются лз ацетатных единиц, которые расположены на том же окислительном уровне, что л углеводы, и после сборки восстанавливаются. [c.473]

Успешное выяснение различных путей биосинтеза, подчас даже его мелких деталей, неизбежно должно было стимулировать разработку аналогичных не катализируемых ферментами, так назы-выемых биомиметических реакций. В ряде случаев в результате химических превращений гипотетических биосинтетических промежуточных соединений удалось с умеренным выходом получить ожидаемые природные соединения. Однако в отсутствие ферментативного контроля такое биогенетическое свидетельство в пользу какой-либо предполагаемой схемы биосинтеза в лучшем случае не убедительно и может даже ввести в заблуждение. [c.341]

При изучении превращения копропорфириногеиа III в протопорфириноген IX внимание исследователей привлекали в основном два вопроса во-первых, последовательность реакций декарбоксилирования и возможное участие других промежуточных соединений и, во-вторых, механизм образования винильной группы. При нормаль-пом метаболизме содержание свободных порфиринов в тканях чрезвычайно мало, но при некоторых генетических заболеваниях, затрагивающих биосинтез гема, или в некоторых специализированных тканях типа железы Гардера они продуцируются в больших количествах. Некоторые из этих порфиринов, имеющих довольно интересные структуры, дали ценную информацию о путях и вероятном механизме ферментативных превращений порфиринов. Одним из наиболее важных соединений этой группы является гарде- [c.654]

В ходе этой реакции возможен дейтериевый обмен с растворителем, однако он идет с довольно низкой скоростью. При использовании в качестве субстрата о-манделата и проведении реакции в среде тритированного растворителя меченые о- и ь-продукты образуются в эквимолярных количествах, что указывает на существование симметричного промежуточного соединения. Эти данные свидетельствуют об образовании промежуточного а-карбаниона, причем в роли акцептора протона выступает ферментативное основание. Лнмнтируюи1,ей стадией является перенос протона, поскольку первичный дейтериевый изотопный эффект достигает 5. Внутри фермент-субстратного комплекса эпимеризация идет с константой скорости порядка 10 с , что соответствует верхнему пределу скорости ферментативного переноса протона. [c.151]

Механизм реакции трансаминирования. Общую теорию механизма ферментативного трансаминирования разработали советские ученые А.Е. Браунштейн и М.М. Шемякин. Одновременно подобный механизм был предложен американскими биохимиками Э. Снеллом и Д. Метцлером. Все трансаминазы (как и декарбоксилазы аминокислот) содержат один и тот же кофермент-пиридоксальфосфат. Для реакций трансаминирования характерен общий механизм. Специфичность трансаминаз обеспечивается белковым компонентом. Ферменты трансаминирования катализируют перенос ЫН,-группы не на а-кетокислоту, а сначала на кофермент пиридоксальфосфат. Образовавшееся промежуточное соединение (шиффово основание) подвергается внутримолекулярным превращениям (лабилизация а-водо-родного атома, перераспределение энергии связи), приводящим к освобождению а-кетокислоты и пиридоксаминфосфата последний на второй [c.435]

Едва ли необходимо убеждать читателя в том, что в наше время практически ни один эксперимент в органической химии или биохимии не обходится без применения спектроскопических методов. Они широко используются для идентификации продуктов химических и ферментативных реакций или более сложных биологических процессов, обнаружения промежуточных соединений (и тем самым для получения ценной информации о механизмах превращений), исследова- ния кинетики и стереохимии химических реакций, пространственной структуры и динамики молекул и надмолекулярных систем, выяснения строения вновь выделенных природных соединений и для многих других целей. [c.5]

В число основных факторов, определяющих начальную скорость ферментативной реакции, входят концентрация фермента и субстрата, pH и температура, наличие активаторов и ингибиторов, причем концентрация субстрата является одним из наиболее важных. График зависимости между начальной скоростью и концентрацией субстрата выражается в виде ветви равнобочной гиперболы. Краеугольным камнем ферментативной кинетики является теория Михаэлиса-Ментен о механизме взаимодействия фермента и субстрата через образование про.межуточного фермент-субстратного комплекса, что является исходным моментом самых современных концепций. Теория исходила из факта, что равновесие между ферментом и субстратом достигается быстрее, чем разрушается фермент-субстратный комплекс. Однако анализ, проведенный Бригсом и Холдейном, показал, что в любой момент реакции скорости образования и распада фермент-субстратного комплекса практически равны, то есть достигается стационарное состояние, в котором концентрация промежуточного соединения постоянна. На основании этого было предложено уравнение, выполняемое для многих механизмов реакций, катализируемых ферментами, которое на- [c.203]