Белки рентгеноструктурная кристаллография

В 1954 г, Лайнус Полинг получил Нобелевскую премию за открытие а-спиральной конфигурации полипептидной цепи, характерной для многих белков. Это открытие явилось началом современной эры применения рентгеноструктурной кристаллографии для установления пространственной структуры сложных органических молекул. Знание такой структуры важно потому, что биологические функции органических молекул зависят от пространственного расположения атомов в молекуле. Дороти Ходжкин установила полную структуру витамина В12 и инсулина. За первую из этих работ она в 1964 г. получила Нобелевскую премию. В 1962 г. за работу по установлению структуры двух глобулярных белков крови— миоглобина и гемоглобина — были награждены Нобелевской премией Джон Кендрью и Макс Перутц, В том же году Фрэнсис Крик, Джеймс Уотсон и Морис Уилкинс были удостоены той же награды за открытие двойной спирали ДНК- [c.224]

За рассеяние рентгеновских лучей, попадающих в кристалл, ответственны электроны атомов кристалла. Интенсивность дифракционных максимумов рассеяния определяется плотностью электронов в атомах тех кристаллических плоскостей, от которых происходит рассеяние. Расшифровывая картину дифракционных максимумов, кристаллографы устанавливают расстояние между плоскостями кристалла, степень их заполнения атомами, размеры элементарной ячейки и получают полное представление о структуре кристалла. Дифракция рентгеновских лучей позволяет исследовать не только такие кристаллические вещества, как различные соли, но также широко используется для установления областей кристалличности в полимерах, например в резине (растянутая резина более кристаллична, чем нерастянутая). Исследование с помощью дифракции рентгеновских лучей белков и других биохимически важных веществ принесло огромную пользу при установлении их строения. Классическим примером возможностей рентгеноструктурного метода является расшифровка с его помощью строения столь сложного вещества, как дезоксирибонуклеиновая кислота (см. гл. 28). [c.176]

После классических работ Перутца, Кендрью и Филлипса кристаллография белков стала быстро развиваться во многих научных центрах. К 1970 г. с помощью рентгеноструктурного анализа были получены трехмерные структуры 18 белков, к 1975 г. - 79, к 1979 г. - 161, к 1989 г. -400. Сейчас это количество приближается к трем тысячам. Одновременно кристаллография белков все больше приобретает для биологии универсальное значение и, наконец, становится неотъемлемой частью исследований, направленных на решение фундаментальных научных и прикладных задач. В настоящее время знание молекулярной пространственной структуры во многом определяет уровень работ и значимость получаемых результатов. [c.74]

По прошествии более трех десятилетий со времени расшифровки структур миоглобина и гемоглобина рентгеноструктурный анализ все еще остается единственным прямым методом определения на атомном уровне пространственного строения белковых молекул, их комплексов и доменов. Полученные с его помощью данные по-прежнему служат незаменимой экспериментальной основой изучения структурно-функциональной организации молекул белков. В 1990-е годы этот метод, по-прежнему сохраняя высокий темп экстенсивного развития, позволил приступить к решению принципиально новых задач, представляющих первостепенный интерес для молекулярной биологии. Основная, если не единственная, причина наметившегося качественного роста возможностей кристаллографии белков связана с использованием вместо излучения рентгеновских трубок синхротронной радиации. [c.74]

Влияние, которое оказали результаты рентгеноструктурного анализа белков на изучение их фракций, детально рассматривается в следующем томе настоящего издания. Здесь хотелось бы обратить внимание на то, что наличие уже в течение нескольких десятилетий уникальной структурной информации все еще не привело к концептуальному развитию или переосмыслению представлений о природе и принципах функционирования белков, сложившихся до становления кристаллографии макромолекул. Ставшие доступными данные рентгеноструктурного анализа о пространственном строении белковых молекул не вызвали качественных изменений в понимании биокатализа, гормон-рецепторных взаимодействий и многих других явлений. Функционирование биосистем молекулярного уровня не обрело строгой трактовки в рамках сформулированных ранее концепций ферментативных и иных реакций, равно как и последние не получили на основе структурных данных своей объективной оценки. По-прежнему, фундаментальные различия между обычными химическими реакциями в растворе и реакциями, осуществляемыми ферментами, продолжают видеться в напряжении и деформации субстрата при его сорбции в активном центре в сторону переходного состояния, в индуцированном соответствии и принудительных конформационных изменениях фермента, в его изна- [c.75]

Мы часто не представляем себе, как глубоко проникает рентгеноструктурный анализ в различные сферы научных исследований. Рентгеновская кристаллография может быть эффективно использована в любой области науки, где требуется знать положение атомов в кристалле. Объектом изучения может быть структура белков, комплексных соединений, органических молекул или минералов. Параллельно собственно структурным исследованиям идет разработка необходимых вычислительных программ, используемых для облегчения сложных расчетов, которые приходится выполнять после получения дифракционных данных. Кроме этого, непрерывно расширяется и улучшается теория кристаллографии, а также совершенствуются методы измерения и сбора экспериментальных данных. [c.7]

Намного больший вклад в наши представления о поведении растворенных макромолекул был внесен кристаллографией в связи с переходами спираль — клубок синтетических полипептидов и полинуклеотидов, которые будут обсуждены в гл. III. Эти явления вводят в физическую химию совершенно новое понятие одномерной кристаллизации . Подобные явления трудно было бы понять, если бы на основе данных рентгеноструктурного анализа не были подробно описаны спиральные конформации цепи главных валентностей в кристаллических глобулярных белках [28] и синтетических полипептидах [29]. Это дало возможность по данным рентгеноструктурного анализа волокон ДНК высказать предположение о биспиральной структуре дезоксирибонуклеиновой кислоты [30 ]. [c.31]

Другая проблема, также связанная с подготовкой кристаллов к съемке, возникла значительно позже, когда в принципе была решена фазовая проблема и встала задача получения кристаллов изоморфных производных. На первых же порах, после получения прекрасных дифракционных снимков глобулярных белков, требовалось решить вопрос об их расшифровке. В чем же заключалась новизна рентгеноструктурного анализа глобулярных белков по сравнению с анализом малых молекул и фибриллярных белков Суть рентгеноструктурного анализа любого монокристалла состоит в определении амплитуд всех дифрагированных лучей (отражений) и их фаз. Зная амплитуды и фазы, можно воспроизвести распределение электронной плотности элементарной кристаллической ячейки и, следовательно, найти ее геометрические параметры, а также параметры структуры образующих ее молекул. Амплитуды определяются по интенсивностям рефлексов, но найти фазы путем непосредственных измерений нельзя. В связи с этим как в кристаллографии малых молекул, так и в кристаллографии белков возникает так называемая фазовая проблема - основная проблема расшифровки любой кристаллографической структуры. В рентгеноструктурном анализе малых молекул для ее решения разработаны прямой метод, метод Паттерсона, метод проб и ошибок, метод изоморфного замещения. Со временем каждый из них приобрел целый ряд [c.40]

К представленному выше материалу о Т-лимфоцитах кристаллография белков прямого отношения не имела. В значительной мере поэтому почти все то, что было сказано о функционировании Т-клеток, молекулярных структурах поверхностных белков и их комплексов, природе и побудительных мотивах антитело-антигенных взаимодействий, работе сигнальных систем и регуляторных механизмов носит общий, феноменологический и предположительный характер. Рентгеновские данные о трехмерных структурах мембранных белков и их отдельных доменов, участвующих в функционировании Т-клеточной иммунной системы, начали появляться лишь в 1990-х годах. Поскольку речь идет главным образом о структурах мембранных белков, то использование метода рентгеновской дифракции в клеточной иммунологии сталкивается с большими препаративными трудностями, не в полной мере еще преодоленными. Впрочем, аналогичная ситуация и во всех других направлениях молекулярной биологии, имеющих дело с изучением явлений, протекающих на поверхности клеток. Поэтому при оценке обсуждаемых ниже конкретных результатов рентгеноструктурного анализа следует учитывать, что они означают только обнадеживающее начало широкого проникновения метода в проблематику Т-клеточной иммунологии. [c.70]

Таким образом, разработанные схемы ферментативного катализа примечательны в том отношении, что они исходят, по существу, из одного и того же экспериментального материала, включающего данные рентгеноструктурного анализа, полученные в последние годы, и базируются на одних и тех же теоретических представлениях о природе биокатализа, сложившихся до становления кристаллографии белков и давно ставших традиционными. На несовершенство сделанных обобщений указывает то обстоятельство, что при единстве исходного опытного материала и теоретической основы, а также в рамках одного подхода была предложена не одна стереохимическая модель функционирования аспартатных протеиназ, а четыре различные модели, которых, впрочем, могло бы быть и больше. Они не образуют ряда, свидетельствующего о количественном развитии знаний о механизме действия ферментов, а скорее представляют собой букет различных точек зрения. Рассмотренные гипотезы отвечают одному уровню понимания изучаемого явления и равноценны как в своей аргументации, так и предсказательной силе. Что же привнесла нового в изучение каталитических реакций аспартатных протеиназ и других ферментов рентгеновская кристаллография белков [c.104]

Итак, с появлением рентгеноструктурного анализа ферментов не произошел переход от умозрительных представлений о ферментативном катализе к строгому количественному описанию этого явления. Не изменилась также направленность биокаталитических исследований, по-прежнему следующих от функции к структуре, что неслучайно, поскольку результатом рентгеноструктурного исследования может быть лишь знание морфологии биосистем атомно-молекулярного уровня, которое само по себе не является конечной целью изучения ферментов. Морфология объекта — это всегда нечто предварительное и совершенно необходимое для последующего изучения структурной и структурно-функциональной организации биосистем. Выяснение с помощью рентгеноструктурного анализа пространственного строения многих сотен молекул ферментов не решило проблему биокатализа, но сделало реальным разработку подхода к изучению ферментативного катализа в направлении от структуры к функции и априорному количественному описанию механизма каталитической реакции. Благодаря развитию кристаллографии белков проблема создания общей теории биокатализа и соответствующих методов расчета впервые обрела форму подлинно научной проблемы, решаемой на уровне современных естественнонаучных знаний. [c.107]

В этом разделе изложены некоторые кристаллографические исследования белков последних лет, которые подтверждают уникальность получаемой с помощью рентгеноструктурного анализа информации и ее определяющее значение в решении проблемы межмолекулярных взаимодействий аминокислотных последовательностей. Кроме того, рассматриваемые ниже работы демонстрируют новейшие достижения кристаллографии, позволившие расшифровывать на атомном уровне трехмерные структуры белков и комплексов, состоящих из тысячи и более аминокислотных остатков. В данном случае, чисто техническое развитие метода, о чем будет говориться в следующей главе, проявилось в наметившемся в начале 1990-х годов переходе от рентгеноструктурных исследований отдельных белковых молекул к не менее детальному изучению пространственных структур макромоле-кулярных белковых олигомеров, их агрегатов с другими соединениями и субклеточными системами. Иными словами, на атомном уровне стали осваиваться структуры более сложных биологических систем. Это значительное событие в молекулярной биологии, новый этап ее развития. Он отражает современную тенденцию эволюции биологи- [c.107]

Самой сложной проблемой рентгеновской кристаллографии белка является фазовая проблема. Именно она около двух десятилетий, когда уже имелась полная ясность в отношении всех других принципиальных вопросов рентгеноструктурного анализа, сдерживала расшифровку дифрагированных белковыми кристаллами пучков лучей, построение карт электронной плотности и установление трехмерных молекулярных структур. Реконструирование пространственного строения белка по наблюдаемым в дифракционной картине многим тысячам рефлексов возможно лишь при знании амплитуды и фазы каждого из них. И если значение амплитуды можно оценить путем прямого измерения интенсивности вторичного рентгеновского излучения, то фаза есть расчетный параметр, нахождение которого непременно связано с привлечением дополнительного экспериментального материала. [c.156]

Два десятилетия (1960—1970-е годы) рентгеноструктурный анализ был единственным методом прямого исследования пространственного строения белков. Его роль и сейчас остается доминирующей. Однако в начале 1980-х годов появились новые методы, дополняющие рентгеноструктурный анализ. Они основаны на применении в кристаллографии белков дифракции нейтронов и гамма-лучей. Эти методы сходны с рентгеноструктурным анализом прежде всего использованием одного и того же состояния исследуемого образца — это также белковый монокристалл и изучаемым явлением — дифракцией, но дифракцией уже других излучений. Явления, происходящие во взаимодействии атомов, упорядоченных в кристаллической решетке молекул белков, с нейтронами и гамма-излучением, сильно отличаются друг от друга и от того, что имеет место при взаимодействии атомов с рентгеновским излучением. Поэтому получаемые от трех методов дифракционные картины не полностью совпадают между собой, а дополняют друг друга, раскрывая новые свойства белковых молекул. Рентгеновские лучи рассеиваются электронной плотностью. Рассеивающая 164 [c.164]

Атомы водорода, не поддающиеся локализации при использовании метода рентгеноструктурного анализа, могут быть легко привнесены в найденную трехмерную структуру белка с помощью хорошо известных стереохимических правил. Такая процедура проводится автоматически на ЭВМ. Однако есть случаи, когда знание положений атомов водорода в молекулярной структуре имеет принципиальное значение и должно быть получено опытным путем. Как правило, это касается активных центров ферментов, где установление конкретных систем водородных связей очень важно, поскольку они играют определенную функциональную роль. В решении подобного вопроса необходимо рентгеноструктурный анализ дополнить изучением дифракции нейтронов. Возможность наблюдать положения водородных атомов значительно расширяет круг решаемых кристаллографией задач. Доступными для изучения становятся некоторые динамические аспекты пространственной организации белков, в частности конформационные флуктуации белковых молекул. В этом отношении одной из перспективных областей применения нейтронной техники является получение качественной информации о процессе замещения водорода на дейтерий, атомы которого по-другому проявляют себя в рассеивании нейтронов. [c.165]

Техника "отжига" в конформационном анализе пептидов и белков часто используется в комбинации с методом молекулярной динамики, в котором температура вводится в расчет посредством кинетической энергии. Самый простой и наиболее распространенный алгоритм этого метода был предложен X. Берендсеном и соавт. [189]. Сравнение его с другими алгоритмами метода молекулярной динамики вьшолнено в работе [190]. Комбинированный метод динамического "отжига" применяется в анализе более или менее сложных пептидов, однако непременно с использованием экспериментальных ограничений, получаемых от рентгеноструктурной кристаллографии и ЯМР [191-194]. Расчет, таким образом, сводится к уточнению уже известной структуры или выбору из небольшого числа предполагаемых вариантов. В разработанном М.Сноу подходе привлекаются данные о гомологии белков [195, 196]. Метод "отжига" широко используется, правда с переменным успехом, в конформационном анализе простых пептидов [197-200], причем наиболее популярным объектом является энкефалин, конформационно достаточно простой эндогенный пентапептид, содержащий два остатка Gly [200-206]. Дж. Хиго и соавт. [207] предложили процедуру длительного "отжига" в комбинации с методом взвешенного набора переменных [208] и минимизацией энергии по вторым производным, позволяющим судить об анизотропии потенциальной поверхности. Авторы использовали процедуру для расчета конформационных состояний пептидных петель в белках, структуры которых известны [209]. [c.244]

Выявление трехмерной структуры миоглобина Джоном Кендрью ]. Кепс1ге у) и гемоглобина Максом Перутцом (М. Реги1г) явилось выдающимся достижением молекулярной биологии. Эти исследования, успешно завершенные в конце 50-х годов, доказали применимость рентгеноструктурного анализа (рентгеноструктурной кристаллографии) для изучения структуры таких макромолекул, как белки. До 1957 г. самой большой из исследованных этим методом молекул был витамин В з, молекулярная масса которого на порядок меньше молекулярной массы миоглобина (17,8 кДа) или гемоглобина (66 кДа). Определение пространственной структуры этих белков послужило огромным стимулом для развития белковой кристаллографии. Проводятся исследования по установлению пространственной структуры большого множества различных белков. Более чем для 50 белков пространственная структура к настоящему времени изучена уже детально. Рентгеноструктурный анализ вносит большой вклад в наши представления о структуре и функции белков, потому что это единственный метод, выявляющий пространственное расположение большинства атомов в белке. Ценным источником информации о структуре биологических макромолекул может служить также электронная микроскопия, однако пока еще она не позволяет выявить [c.50]

В 1912 г. Лауэ предположил, что длина волны рентгеновских лучей может быть примерно равной расстоянию между атомами в кристалле таким образом, кристалл может служить дифракционной решеткой для рентгеновских лучей. Этот опыт был проведен Фридрихом и Книппингом, которые действительно наблюдали дифракцию. Вскоре Брэгг (1913 г.) улучшил эксперимент Лауэ в основном путем замены монохроматического излучения полихроматическим и тем, что дал физическую интерпретацию теории рассеяния Лауэ. Брэгг также определил структуру ряда простых кристаллов, включая Na l, s l и ZnS. Со времени возникновения рентгеновской кристаллографии как науки рентгеноструктурный анализ монокристаллов превратился в наиболее широко применяемый и самый мощный метод определения расположения атомов в твердом теле. После 50-х годов с появлением быстродействующих электронно-вычислительных машин, способных обрабатывать рентгенографические данные, стал возможен более детальный анализ структуры таких сложных соединений, как белки. [c.565]

Рентгеноструктурные исследования, оказавшие огромное влияние на развитие кристаллографии белков, принадлежат У. Астбэри. Выбрав в качестве критерия структурный признак, он по наблюдаемым дифракционным картинам разделил фибриллярные белки на две группы. В первую (группа к.т.е. .) вошли кератин, миозин, эпидермин, фибриноген, а во вторую (группа коллагена) - белки сухожилий, соединительных тканей, хрящей и др. У. Астбэри обнаружил, что белки группы к.т.е.Г, имея [c.68]

В 1950 г. публикуется исследование Л. Брэгга, Дж. Кендрью и М. Пе-рутца, в котором сообщаются не только вновь полученные авторами данные рентгеноструктурного анализа миоглобина и гемоглобина, но анализируется сложившаяся в кристаллографии белков общая ситуация. Авторы подводят итог предшествующим исследованиям в этой области и в заключении формулируют важную гипотезу о родственном пространственном строении белков, которая представляет собой дальнейшее, подкрепленное новыми наблюдениями развитие взглядов Астбэри и Хаггинса на структурное единство белковых молекул. [c.70]

Заметный прогресс в изучении структуры белков начался с конца 70-х годов текущего столетия Если до этого структуры их выводили на основании метода диффракции нейтронов, карт распределения электронных плотностей с введением в молекулы белков тяжелых атомов, то в последующие годы были развиты методы синхронной радиации, методы с использованием компьютерной техники, что сослужило огромнзто службу кристаллографии данных биополимеров В этой связи статичный метена, рентгеноструктурного анализа одиночного кристалла способен дать ди-намичнзгю информацию На основании указанных методов показано, например, что фермент лизоцим имеет оболочку из 33—35 прочно связанных молекул воды и менее упорядоченную область из 95—105 молекул воды, соединенных с белком лишь одной водородной связью Около 60—80% остальной воды распределено в промежутках между кристаллами и не влияет на электронную плотность белка [c.71]

Развитие рентгеноструктурного анализа — это увлекательная история, начинающаяся с выяснения структуры одноатомных металлов и минеральных солей. В настоящее время этот метод используют для изучения очень сложных молекул, таких, как белки и вирусы. Число органических и металлорганических соединений, изученных с помощью рентгеноструктурного анализа, приближается к 50 ООО. Результаты этих исследований собраны в банке структурных данных [136], обеспечивающем порядок и полноту информации [137]. Целью этой главы являлось рассмотрение факторов, определяющих развитие метода, а именно наличие автоматических дифрактометров, цифровых вычислительных. машин, систем и комплексов кристаллографических программ. Прогресс в кристаллографии тесно связан с прогрессом в технологии компьютеров и ди-фрактрометров (пример — успешная разработка координатного детектора [138]), а также с развитием новых методов решения и уточнения структуры. Благодаря доступности метода и программ современная кристаллография стала популярным методом исследования. В исследовательских проектах, требующих точных структурных данных, неспециалисты в кристаллографии получают результаты, которые невозможно получить другими методами. Мы не пытались рассмотреть здесь многочисленные публикации, посвященные изучению разнообразных химических соединений. [c.269]

Наиболее точные данные о расположении атомов в кристаллах можно непосредственно получить с помощью дифракционных методов — рентгеноструктурного анализа, нейтроцо- и электронографического методов. Эти методы основываются на измерении интенсивности пучков рентгеновских лучей, нейтронов или электронов, отраженных от различных плоскостей кристаллической решетки исследуемого вещества. Количество получаемых таким путем интенсивностей весьма велико для кристаллических структур средней сложности оно составляет несколько сотен, а для кристаллов белков достигает многих тысяч. Для получения информации о расположении атомов в кристалле на основе этих экспериментальных данных (полученных одним из методов) необходимы громоздкие и сложные вычисления. Однако широкое распространение вычислительных машин значительно облегчило труд кристаллографов и сделало возможным применение новых, более точных методов вычислений. В этой главе будут рассмотрены основные методь расчета, применяющиеся в современной кристаллографии, в том числе и программа вычислений, разработанная во Вроцлавском центре для счетной машины Эллиотт-803. [c.233]

Три группы исследователей продолжили оставленную в начале 50-х годов Астбюри работу, связанную с рентгеноструктурным анализом ДНК. Первая группа включала Полинга и его коллег, недавний феноменальный успех которых в выяснении вторичной структуры белка поощрил их использовать этот метод и для изучения ДНК. Попытки Полинга не увенчались успехом, и предложенная им в 1953 г. модель структуры ДНК была забракована сразу же после ее опубликования. Вторая группа, работавшая под руководством Уилкинса, достигла важного методического решения им удалось приготовить высокоориентированные нити ДНК, которые позволяли получить рентгенограмму, показывающую множество ранее не проявлявшихся деталей (фиг. 78). На этой превосходной рентгенограмме, использованной в работе Розалинд Франклин, имелись особенности, которые сразу же делали некоторые детали очевидными для тренированного глаза кристаллографа. В часиюсти, с определенностью подтверждается сделанный ранее Астбюри вывод о существовании межнуклеотидпого расстояния в 3,4 А. Зимой 1952—1953 г., когда Уилкинс и его сотрудники все еще пытались обратить свои данные в приемлемую модель структуры ДНК, рентгенограмму Франклин увидели Джеймс Уотсон и Френсис Крик, которые представляли собой третью группу, занимавшуюся в то время выяснением структуры ДНК. Уотсон и Крик к тому времени уже рассмотрели несколько возможных вариантов структуры, однако из-за плохого качества рентгенограмм им не удалось прийти к каким-либо определенным выводам. Рентгенограмма Франклин помогла им узнать необходимое, и в течение нескольких недель вопрос о структуре ДНК был решен. [c.173]

Применение рентгеноструктурного анализа в середине XX в. позволило выявить трехмерную структуру миоглобина (Д. Кендрью) и гемоглобина (М. Перутц) — важнейших порфиринсодержащих белков, служащих переносчиками кислорода в организмах животных. Определение пространственной структуры этих белков послужило огромным стимулом для развития молекулярной биологии и смежных наук (например, белковой кристаллографии). [c.202]

Систематическая работа с белками началась в конце 1920-х годов У. Астбери, который был привлечен для решения проблемы пространственного строения шерстяных волокон У. Брэггом. Позднее в содружестве со специалистами по химии шерсти он изучал с помощью рентгеноструктурного анализа фибриллярные белки, начав с кератина (см. гл. 1). Другой выдающийся ученик школы У. Брэгга, Дж. Бернал, начал в 1934 г. изучение кристаллических глобулярных белков. Он работал с И. Фанкухеном и Д. Кроуфут (Ходжкин). Вскоре к ним присоединились М. Перутц, бывший студент Л. Брэгга, избравший в 1937 г. предметом своей диссертации определение кристаллической структуры гемоглобина, Д. Райли и Дж. Бойес-Уотсон. С 1946 г. сначала вместе с М. Перутцем, а потом самостоятельно в этой области начал работать Дж. Кендрью, также ученик Л. Брэгга, а с 1955 г. -Д. Филлипс. Если сюда же присоединить Ф. Крика, ставшего заниматься белками в 1949 г., то получим почти полный список лиц, создавших кристаллографию белка и вьшолнивших пионерские исследования по расшифровке трехмерных структур белковых молекул. Путь к этому прошел через решение следующих проблем 1) получение белковых кристаллов 2) решение проблем фаз 3) получение изоморфных [c.39]

В этой и следующей главах в краткой форме рассматриваются результаты рентгеноструктурных исследований белков, которые в чем-то, например, сложности объектов анализа, их особой познавательной цешюсти или прикладной актуальности, точности определения координат атомов или каких-то методологических и препаративных новшеств, являются на сегодняшний день наивысшими достижениями. Рассмотрение, вероятно, поможет составить представление о состоянии и возможностях рентгеновской кристаллографии белков первой половины 1990-х годов. [c.55]

Для того чтобы с хорошим разрешением получить трехмерную структуру белка и увидеть расположение сотен или тысяч его неводородных атомов, необхс)Димо иметь большие кристаллы с высокой степенью упорядоченности. Природа не наделила белковые молекулы свойством спонтанно создавать регулярные макроскопические структуры. В естественных условиях они не образуются их нет в клетках и живых организмах. Поэтому получение из белков монокристаллических образцов в лабораторных условиях, как правило, - самый длительный этап рентгеноструктурного анализа, который может продолжаться годами и закончиться безрезультатно. Именно так до недавних пор завершались все попытки закристаллизовать мембранные белки, которые все это время оказывались как бы вне компетенции рентгеновской кристаллографии. Десятилетиями объектами рентгеноструктурного анализа оставались водорастворимые глобулярные белки. [c.55]

Миозин является объектом всестороннего изучения практически на протяжении всего XX столетия. Еще в исследованиях А.Я. Данилевского в конце прошлого века отмечалось, что миозин обладает двойным лучепреломлением. Однако до самого последнего времени все знания о пространственной структуре ограничивались информацией о внешнем очертании молекулы и ее габаритных размерах, полученных с помощью электронной микроскопии. В частности, было известно, что миозиновая головка имеет грушевидную форму 190 A в длину и 50 A в ширину, а двойная спираль хвостового участка соответственно 1500 и 20 А [468-471]. Последние три десятилетия камнем преткновения в определении трехмерной структуры миозина, как и структуры актина, было получение качественных кристаллов белка для рентгеноструктурного анализа. И. Рейменту и соавт. удалось получить требуемые кристаллы, использовав не совсем обычный в белковой кристаллографии прием - N-метилирование боковых цепей всех остатков Lys миозинового фрагмента I в мягких условиях [472]. Для того чтобы убедиться в том, что метилирование не привело к радикальному изменению конформационных и ферментативных свойств белка, авторы подвергли подобной химической модификации лизоцим и не обнаружили после этой процедуры существенных нарушений в трехмерной структуре фермента. Кроме того, были проверены кинетические свойства метилированного миозина SI [473]. Он сохранял каталитическую активность, хотя и наблюдались отклоне- [c.125]

Предшествующая глава была посвящена рентгеноструктурным исследованиям белков, научная значимость и новизна которых обусловлены не столько методологическими и техническими достижениями кристаллографии, сколько важностью самих объектов анализа. В ней рассмотрены ставшие впервые известными лишь в 1990-е годы пространственные структуры молекул мембранных рецепторов, иммунных белков Т-лимфоцитов, гистонового октамерного кора нуклеосом, ДНК-топоизомеразы, аспартатных протеиназ ретровирусов и белков актомиозинового комплекса скелетных мышц. Рентгеноструктурный анализ получил широчайшее распространение и в течение более тридцати лет практически безраздельно определяет экстенсивное развитие морфологии биосистем атомно-молекулярного уровня. К настоящему времени с его помощью расшифрованы трехмерные структуры нескольких тысяч белков, полипептидных фрагментов и макромолекулярных комплексов. Вне сомнения, даже при сохранении сегодняшнего состояния рентгеноструктурного анализа изучение пространственного строения белков будет продолжаться в обозримом будущем с возрастающей интенсивностью как в отношении количества, так и сложности исследуемых объектов. Между тем, работы такого плана не дают полного представления о конформационных возможностях белковых молекул и не всегда приводят к объективным заключениям о [c.137]

Самым существенным методологическим достижением рентгеноструктурного анализа последнего десятилетия, по-видимому, можно считать начавшееся применение в кристаллографии белков синхротронной радиации, значительно более мощной по сравнению с излучением традиционных источников. В первый период становления рентгеноструктурного анализа, 1960-1970-е годы, большинство трехмерных структур белков было расшифровано с использованием запаянных острофокусных трубок с медным анодом, имеющих характеристическую длину волны X (Ка) 1,54 А И фокусное пятно примерно 8,0 X 0,4 мм. Интенсивность излучения таких трубок ограничивалась скоростью отвода тепла от анода и при малых кристаллах белков с большими элементарными ячейками не обеспечивала желаемого разрешения. В конце 1970-х годов появились трубки с вращающимся анодом и фокусом 2,0 х 0,2 мм. Их яркость, оцениваемая потоком фотонов коллимированного рентгеновского пучка (Ю -Ю фотонов в с), была в несколько раз выше, чем у лучших запаянных трубок, а фокусировка пучка на заметно меньшую площадь позволяла получать дифракционные картины с более высоким разрешением и меньшей экспозицией. В настоящее время рентгеновские трубки с вращающимся анодом и никелевым или графитовым фильтрами применяются в анализе повсеместно. [c.138]

Рассмотренные в этой главе исследования, по-видимому, не оставляют сомнений в том, что в 1990-е годы рентгеноструктурный анализ белков, по-прежнему сохраняя высокий темп экстенсивного развития, приступил к решению принципиально новых задач, представляющих первостепенный интерес для молекулярной биологии. Основная, если не единственная, причина наметившегося качественного изменения возможностей кристаллографии макромолекул связана с использованием синхротронной радиации. Переход к новому источнику рентгеновского излучения, во-первых, ослабляет требования, предъявляемые к размерам кристаллов, что особенно важно в структурном анализе высокомолекулярных белков и их комплексов, имеющих крупные элементарные ячейки. Во-вторых, сплошной спектр синхротронной радиации и легкость выбора любой длины волны монохроматического излучения дали возможность по-новому подойти к решению фазовой проблемы и разработать метод мультидлинноволновой аномальной дифракции, требующий для фазирования одного кристаллического образца. Существенным дополнением метода МАД стал способ рекомбинантного получения в ауксотрофных клетках белков, в аминокислотных последовательностях которых все остатки метионина заменены на селенометионин. Использование [Se-Met] белков не только освобождает рентгеноструктурный анализ от длительной рутинной процедуры приготовления нескольких изоморфных белковых производных тяжелых атомов, но практически снимает саму проблему изоморфизма. [c.163]

Таким образом, ближайшие перспективы развития рентгеноструктурного анализа белков будут определяться достижениями в использовании синхротронной радиации в трех отмеченных направлениях синтезе и кристаллизации белков, а также условиях проведения эксперимента. Продолжится наметившееся сближение рентгеноструктурного анализа белка с методами малоуглового рассеяния, флюоресценции, криомикроскопии, лазерной, ЯМР- и УФ-спектроскопии и т.д. Сделанные прогнозы касаются кумулятивного развития кристаллографии белка и, следовательно, говорят о его тактических целях. Что же касается стратегического прогноза, то он не может быть известен, поскольку развитие науки, являясь нелинейным неравновесным процессом, не имеет конечной цели и непредсказуемо в принципе. [c.164]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология