Денатурация органическими растворителям

Цель избирательной денатурации состоит в создании таких условий, при которых нужный фермент или совсем не денатурирует, или же потери его составляют не более 10—20%, тогда как множество других компонентов смеси денатурирует и в основном осаждается в результате проведенной обработки. Для избирательной денатурации используют преимущественно 1) температуру, 2) pH и 3) органические растворители. Эти три способа воздействия обычно взаимосвязаны, поскольку денатурация под действием температуры в большой степени зависит от значений pH, и наоборот. При денатурации органическими растворителями необходимо тщательно подбирать температуру, pH и величину ионной силы. Ионная сила может несколько изменять влияние температуры и pH, особенно если сравнивать поведение белков при низкой ионной силе (от 0,01 до 0,1) с их поведением при высокой концентрации соли, например в 1 М растворе сульфата аммония. Эти три типа денатурации рассматриваются ниже. [c.83]

Большинство ферментов являются лабильными белками. При переводе их в экстракт они лишаются своего естественного (в клетке) окружения и легко подвергаются денатурации и инактивации под влиянием различных факторов. В связи с этим при выделении и очистке ферментов необходимо соблюдать целый ряд предосторожностей. Как правило, все операции следует проводить при 2—4° С (лучше — в холодной комнате), а фракционирование органическими растворителями — при температуре ниже О С. [c.196]

Денатурация органическими растворителями [c.89]

Для денатурации органическим растворителем необходимо очень тщательно подбирать pH и температурный режим, так как эти три фактора оказывают совместное действие на белки. Поскольку существует множество различных вариантов, практически невозможно добиться идеальных условий проведения процесса, т. е. таких, при которых максимальное сохранение активности нужного фермента сочеталось бы с максимальным разрушением других белков. С другой стороны, для подбора условий, близких к оптимальным, можно провести много пробных тестов за короткое время с малыми объемами образца. [c.90]

Денатурирующими агентами могут быть различные химические факторы кислоты и щелочи, изменяющие реакцию среды белковых растворов, выходящую за пределы значения pH от 3 до 10, т. е. лежащего вне зоны устойчивости белковых молекул разные легко гидратирующиеся соли, которые могут не только высаливать белки, по и денатурировать их в этом отношении остается справедливым лиотропный ряд для анионов Гофмейстера, в котором роданид и близлежащие к нему анионы вызывают денатурацию, в противоположность сульфатному концу ряда органические растворители, например ацетон, этиловый и метиловый спирты и др., снимающие водную оболочку у белков соответствующие окислители, производящие разрыв дисульфидных мостиков в белковой молекуле гуанидин и карбамид (мочевина), изменяющие количество водородных связей и, следовательно, конфигурацию белка (как бы производят плавление его комплексной спиральной структуры) и др. [c.209]

Спирт, ацетон и другие, смешивающиеся с водой органические растворители осаждают протеины из водных растворов, причем разные протеины требуют различной концентрации осадителя. При коротком воздействии этих осадителей, после удаления их, промытые водой протеины вновь растворяются в воде. Длительное воздействие этих жидкостей, растворимых в воде, производит более глубокое изменение в протеинах и делает их в дальнейшем нерастворимыми в воде такие реакции осаждения необратимы, протеины после удаления вещества, вызвавшего осаждение, в воде не растворяются. Происходят изменения, называемые денатурацией белковых веществ. [c.23]

Белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи). Поэтому обычные методы органической химии, применяемые для вьщеления того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.), в данном случае неприемлемы. Белки в этих условиях подвергаются денатурации, т.е. теряют некоторые существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость, биологическую активность. Разработаны эффективные методы выделения белков в мягких условиях, при низкой температуре (не выше 4°С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов. [c.23]

ПИРИДИН С. НэК — шестичленный гетероцикл с одним атомом азота, бесцветная жидкость с резким неприятным запахом, т, кип. 115,58° С смешивается с водой и органическими растворителями. П.— слабое основание, дает соли с минеральными кислотами, легко образует двойные соли и комплексные соединения. Получают П. из каменноугольной смолы, применяют в синтезе красителей, лекарственных препаратов, инсектицидов в аналитической химии как растворитель многих органических и неорганических веществ, для денатурации спирта. П. токсичен, действует на нервную систему, кожу. Максимально допустимая концентрация в воздухе 0,005 мг/л. [c.190]

При действии электролитов или органических растворителей (спирт, хлороформ) на растворы белков происходит их осаждение (свертывание). Нагревание же приводит к необратимому осаждению и утрате многих свойств. Такое явление получило название денатурации белка. Под этим подразумевается такое превращение белка, которое приводит к потере его естественных свойств. Следствием такого процесса является нарушешге структуры белковой молекулы. Первичная структура каким-либо изменениям в этом случае не подвергается. [c.427]

Белки находятся в природном, или нативном состоянии, если они обладают определенным строением, окружены молекулами воды (сольва-тированы) и не находятся в нейтральном состоянии. Если нарушается природная структура белка, то наступает его денатурация. Денатурация может возникнуть, например, под влиянием высокой температуры, органических растворителей, сильных кислот или оснований, солей тяжелых металлов. [c.23]

После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению —фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др. [c.26]

Белки имеют большую молекулярную массу (10" —10 ), многие белки растворимы в воде, но образуют, как правило, коллоидные растворы, из которых выпадают при увеличении концентрации неорганических солей, добавлении солей тяжелых металлов, органических растворителей или при нагревании (денатурация). [c.500]

Растворимые белки крайне чувствительны к нагреванию, кислотам, основаниям, органическим растворителям и другим химическим соединениям, производящим их денатурацию. Во избежание денатурации операции выделения и очистки следует проводить нри возможно низкой температуре и достаточно быстро, причем следует также избегать попадания бактерий, так как растворы белков являются благоприятной средой для их развития. [c.416]

Денатурация белков может быть произведена, кроме нагревания (и других форм энергии, как, например, ультрафиолетового излучения или высоких давлений), некоторыми химическими веществами. Различают три категории подобных денатурирующих агентов вещества, вызывающие ионизацию (кислоты, основания), вещества, денатурирующие белки в их изоэлектрической точке (мочевина, гуанидин, салицилаты, тиоцианаты и различные детергенты, причем последние действуют в небольших концентрациях) и некоторые органические растворители (снирт, ацетон). [c.439]

Наиболее важным для технологии свойством белков является способность их денатурироваться. Под денатурацией понимают внутримолекулярные изменения структуры природного белка, не сопровождающиеся гидролизом первичных связей между составляющими белок аминокислотами. Денатурация белка происходит под влиянием таких технологических факторов, как тепло, органические растворители, внешнее давление при прессовании и измельчении, а также другие неблагоприятные внешние воздействия. Наиболее заметным проявлением денатурации является изменение растворимости белка и его пластических (физикомеханических) свойств. [c.30]

Белки под влиянием нагревания или воздействия органических растворителей, концентрированных кислот или щелочей претерпевают глубокие изменения, называемые денатурацией. При денатурации существенно изменяется третичная структура молекулы белка за счет перегруппировки некоторых внутримолекулярных связей (водородных, дисульфид-ных и др.). В результате нарушаются некоторые физические, химические и биологические свойства белковых молекул. Теряется способность белка растворяться в обычных для него растворителях (вода, солевые растворы и др.). Иначе говоря, белки при денатурации теряют свои гидрофильные свойства и приобретают гидрофобные. Такой вид денатурации называется необратимой денатурацией в отличие от обратимой, при которой изменения в молекуле белка бывают неглубокими и белок при определенных условиях может вновь приобретать свой нативные (т. е. натуральные) свойства. [c.26]

Осаждение органическими растворителями. Для избирательного осаждения белков можно использовать органические растворители, например ацетон, метанол и этанол. Однако следует иметь в виду, что добавление этих растворителей часто приводит к денатурации белков поэтому работать с ними лучше при очень низких температурах. [c.80]

Многие белки растворимы в воде, в разбавленных растворах солей, в кислотах. Почти все белки растворяются в ш,елочах, и все они нерастворимы в органических растворителях. Растворы белков имеют коллоидный характер и могут быть очищены диализом. Из растворов белки легко осаждаются органическими водорастворимыми растворителями (спиртом, ацетоном), растворами солей, особенно солей тяжелых металлов (Си, РЬ, Hg, Ре и др.), кислотами и т. д. Осаждением растворами солей различной концентрации белки могут быть очищены и разделены. При осаждении некоторые белки меняют конформацию цепей и переходят в нерастворимое состояние. Этот процесс называется денатурацией. Денатурация многих белков может быть вызвана и нагреванием. [c.506]

Между белками и пептидами трудно провести четкую границу. Согласно одному из возможных способов классификации, белками называют только те соединения, молекулярная масса которых превышает 10 ООО. Классификация может также основываться на различиях в физических свойствах при учете, в частности, гидратации и конформационных отношений. Встречающиеся в природе пептиды имеют сравнительно короткие подвижные цепи, и хотя они гидратируются в водных растворах, этот процесс обратим в то же время в белках содержатся очень длинные цепи, которые могут быть свернуты и изогнуты самыми различными способами. Молекулы воды при этом заполняют промежутки между цепями. При нагревании или под действием органических растворителей солей и т. д. молекулы белка претерпевают более или менее необратимые изменения, называемые денатурацией при этом изменяются как конформационные отношения в цепях, так и степень гидратации. Результатом обычно оказывается понижение растворимости и потеря способности к кристаллизации. [c.115]

Влияние органических растворителей на денатурацию белковых веществ. При взаимодействии с органическими растворителями (бензином, гексаном) белковые вещества масличных семян претерпевают структурные изменения — белки денатурируются. При этом степень денатурации белка гораздо меньше, чем теп- [c.232]

Менее ясен вопрос о денатурации под действием органических растворителей. Хотя при действии формамида разделение цепей происходит вероятно, возможны случаи денатурации и без разделения цепей [c.267]

Солеобразные связи обычно образуются в среде с малой диэлектрической проницаемостью, например в органических растворителях или внутри гидрофобного ядра молекулы глобулярного белка. Образование их в водной среде менее вероятно. Поскольку образование солеобразных связей увеличивает и без того большую диэлектрическую проницаемость водных растворов, мочевина должна ослаблять такие связи. Между некоторыми типами водородных связей и некоторыми солеобразными связями нет резкой границы. Примерами образования солеобразных связей могут служить связи молекул белка с ионами щелочных металлов. По-видимому, солеобразные связи не влияют заметно на вторичную и третичную структуру, поскольку добавление солей, уменьшающих электростатическое взаимодействие, не очень эффективно в отношении денатурации. Однако частичное разрушение четвертичной структуры гемоглобина при высоких концентрациях соли свидетельствует о том, что эти связи все же влияют на стабильность молекулы. [c.275]

Отмечено, что низкая температура предохраняет белки от денатурации и в то же время усиливает осаждающее действие (например, спирта), т. е. улучшает фракционирование. Считают, что осаждающее действие органических растворителей, в частности этанола, обусловливается низкой диэлектрической константой смеси этанол-вода. Белки и иные коллоидные вещества в присутствии какого-либо органического растворителя образуют агрегаты, поскольку сила электростатического притяжения белковых молекул обратно пропорциональна диэлектрической постоянной среды. Следует иметь в виду, что подобные простые закономерности в растворах сложных многозарядных частиц со сложной пространственной структурой, какими являются белки, могут не всегда оправдываться, и что в действительности наблюдаемое изменение зависит от многих причин. Большое значение [c.145]

Основным недостатком ионов тяжелых металлов является то, что, как и органические растворители, они обладают способностью интенсивно денатурировать белки. Однако тщательное регулирование температуры и pH значительно снижает вероятность необратимой денатурации (инактивирования) ферментов ртуть, например, которая в высшей степени ядовита для большинства [c.148]

В начале, по-видимому, всегда целесообразно отделить заметную часть балластных белков путем фракционной денатурации прогреванием или осаждением в слабокислой среде. Наоборот, кристаллизацию выгоднее проводить на заключительных этапах очистки. Основными операциями, выполняемыми на средних стадиях, являются фракционирование органическими растворителями, нейтральными солями, адсорбцией или хроматографическим разделением на колонках, в том числе с применением ионообменников. Очень важно, по возможности, чередовать этапы таким образом, чтобы избежать операции диализа. Так, высаливание, удобное в качестве первого этапа, требует диализа, но фракционирование спиртом позволяет его избежать. Простого прибора для быстрого диализа больших объемов жидкостей пока еще не существует можно полагать, что из всех способов очистки диализ — самый медленный и неудобный. Его легче проводить в заключительных стадиях, когда вещества уже мало и объемы невелики. Во время диализа возможны значительные потери активности фермента. С большими объемами жидкостей неудобно работать и в колонках последние лучше использовать [c.155]

Белки относительно малых размеров можно фракционировать и на колонках типа jg при условии их растворимости в ацетонит-риле можно использовать для элюции градиент его концентрации вплоть до 60% [Ni e et al., 1979]. Рассматривая важную проблему денатурации белков в процессе хроматографии, авторы отмечают, что опасность связана не столько с относительно кратковременным пребыванием белка в водно-органическом растворителе, сколько с самим актом гидрофобного взаимодействия белка с матрицей. В результате этого взаимодействия могут нарушиться внутренние гидрофобные связи в белковой глобуле, от которых зависит сохранение ее нативной структуры. [c.211]

Биологическая активность фермента в ходе хроматографии может измениться (как уменьшиться, так иногда в возрасти) в силу ряда дополнительных причин. Например, кажущееся увеличение активности фермента может быть результатом его отделения от протеаз. Снизиться активность может как в результате истинной денатурации илп окисления 8Н-групп белка, так и при отделении апофермепта от кофакторов. Иногда инактивация обусловлена разъединением двух или нескольких последовательно работающих ферментов. Такого рода кажущиеся инактивации могут быть обнаружены при объединении хроматографических фракций, когда активность фермента восстанавливается. Для сохранения биологической активности липофильных белков мембран в элюент иногда приходится добавлять спирт или ацетон. При этом может возникнуть определенная неравномерность распределения органического растворителя между жидкостью внутри и снаружи гранул — ионы сорбента, гидратируясь, оттягивают на себя воду. Следствие этой неравномерности — наложение на ионный обмен эффекта распределетельной хроматографии. Для сохранения биологической активности ферментов в элюент часто добавляют глицерин (до 25%) или этиленгликоль (до 5%). [c.292]

Факторы, вы- ывающие денатурацию, можно разделить на две группы фияичеекис и химические. К физическим относятся высокая температура, механические воздействия, обработка ультразвуком, действие ионизирующих излучений к химическим — осаждение ионами тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, нейтральными солями аммония, щелочных и щелочноземельных металлов органическими растворителями, алкалоидными реактивами. Аналогичное по результатам действие оказывают детергенты, мочевина, некоторые красители. [c.19]

При обратимом осаждении макромолекулы бе-чка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе (например, воде). Обратимое осаждение вызывается дейстгзием нейтральных солей аммония, ни лоч-ных и н елочноземачьных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и незсоторых других органических растворителей. [c.19]

Однако, было обнаружено, что большинство биокатализаторов (биомасса микроорганизмов, собранная с поверхности агари-зованпой среды) вообще не работает в этих условиях. Это согласуется с имеющимся в летературе представлением о том, что окислительно-восстановительные биотрансформации редко реализуются в органических растворителях из-за способности последних растворять цитоплазматические мембраны клеток, а также вызывать денатурацию самих ферментов. [c.64]

Образование каротинопротеннового комплекса обычно приводит к значительному батохромному сдвигу в спектре поглощения (рис. 2.12), и потому эти комплексы часто имеют пурпурный, голубой или зеленый цвет в отличие от желтой или оранжевой окраски свободных каротиноидов. По-видимому, важную роль в спектральном сдвиге играют кетогруппы каротиноидных простетических групп, обычно представленных кан-таксантнном или астаксантином, однако природа каротинопротеинового связывания пока остается неясной. Показано лишь, что во взаимодействии каротиноидов с белком не участвуют ковалентные связи, поскольку свободный каротиноид легко высвобождается при денатурации белка нагреванием или органическими растворителями, причем иногда этот процесс обратим. [c.59]

Связывание фермента с гидрофильной матрицей полимера заметно повыц его устойчивость к денатурации при нагревании. Полиакриламидные носит значительно инертнее целлюлоз, и поэтому физически адсорбирующиеся бе и ферменты легче отмываются от них, чем от целлюлозных носителей. Это i возможность значительно дольше повторно использовать полиакриламидные Сители по сравнению с целлюлозными носителями. Полиакриламидные носит нерастворимы в воде и многих органических растворителях — ацетоне, бенз( диметилформамиде, диоксане, этилацетате, пиридине, этаноле, уксусной ки( те и др. [c.190]

Так же как и двухцепочечные полинуклеотиды, одноцепочечные молекулы могут денатурировать с разрушением вторичной и третичной структур. Денатурация наблюдается при повышении температуры, понижении ионной силы или добавлении в среду дена-турирующих агентов — мочевины, органических растворителей и т. д. [c.344]

Изменение пространственной структуры белка без разрушения пептидных связей под действием различных физических факторов (нагревание, действие ультразвука, ультрафиолетовое й радиоактивное излучение и т. д.) и химических вевдеств (крепкие кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, органические растворители) называется денатурацией. [c.37]

Гидрофильные свойства нерастворимых носителей желательны не только потому, что необходимо свести к минимуму неспе-цифическую сорбцию и инактивацию, но также и потому, что на носителях с гидрофобными свойствами может уменьшаться стабильность некоторых связанных ферментов в результате денатурации, аналогичной той, которая вызывается органическими растворителями. [c.177]

Еще одно важное следствие денатурации белка заключается в том, что белок почти всегда утрачивает характерную для него биологическую активность. Так, если водный раствор фермента кипятить в течение нескольких минут, а затем охладить, то фермент, как правило, становится нерастворимым и, что особенно важно, уже не обладает каталитической активностью. Денатурацию белков вызывает не только нагревание, но и воздействие экстремальньк значений pH, добавление к раствору белка некоторых органических растворителей, таких, как спирт или ацетон, обработка мочевиной или детергентами и даже сильное взбалтывание бежевого раствора на воздухе до тех пор, пока он не вспенится. Каждый из этих способов денатурации можно рассматривать как относительно мягкую обработку. В самом деле, прямые эксперименты показывают, что денатурация не сопровождается разрывом ковалентных связей в полипептидной цепи. Следовательно, аминокислотная последовательность белка после денатурации не изменяется тем не менее большинство белков при этом утрачивает биологическую активность. Отсюда [c.159]

Потеря специфики вторичной и третичной структур называется денатурацией белка. При этом активный центр фермента демонтируется , что приводит к потере каталитической активности. Денатурация может быть вызвана добавкой концентрированного раствора электролита или органических растворителей, а также повышением температуры. Последнее обстоятельство обусловливает своеобразный ход температурной зависимости скорости ферментативных реакций. При умеренных температурах повышение температуры сопровождается, как обычно, увеличением скорости. Затем достигается максимум, после чего дальнейщее повышение температуры приводит в результате прогрессирующей денатурации фермента к падению скорости, вплоть до полного прекращения каталитической реакции. [c.430]

Денатурацию вызывают различные агенты и факторы тепло, ультрафиолетовое излучение, органические растворители, мочевина, солянокислый гуанидин, бромистый литий, детергенты, кислоты, щелочи и т. д. Состояния, к которым приводит вызванная этими агентами денатурация, могут быть весьма различными. Так, например, полная денатурация нагреванием часто оказывается необратимой, а денатурация под действием лгочевины обычно обратима — при удалении мочевины нативная форма белка восстанавливается. Совершенно очевидно, что состояния, в которых оказывается молекула белка при обратимой и необратимой денатурации, должны существенно различаться. [c.115]

У фикобилинов белково-пигментная связь особенно прочна. Она не разрывается органическими растворителями, вызывающими денатурацию белков, в противоположность хлорофилло-белковой связи. Даже после расщепления пепсином части разрушенных молекул белка все еще связаны с пигментом. Поэтому Лемберг считает, что пигмент связан с белком истинной химической связью, например пептидной Е СО—КНЕ", где К СООН—пигмент, а К"КНа—белок. [c.482]

Из множества способов измельчения сырья в промышленном производстве ферментных препаратов применение нашл различные способы механического разрушения тканей и клеток (с помощью мясорубок, куттеров, гомогенизаторов, растиранием). Кроме того, используют действие органических растворителей, автолиз, например дрожжей, реже — замораживание и оттаивание. Действие ультразвука или вводимых извне ферментов— лизоцима, целлюлаз и т. п.—применяется мало. Удаление балластных белков кратковременным прогреванием или изменением pH среды используется во многих производствах. Можно отметить, что эти операции, легко проводимые в лабораторных условиях, становятся довольно опасными в производстве, когда они выполняются с большими количествами веществ и в связи с этим замедляются. Здесь необходим тщательный контроль стабильности (денатурации и инактивирования) основного выделяемого белка. Это соображение, впрочем, относится практичес ки ко всем операциям препаративной химии ферментов. [c.156]

К способам денатурации преимущественно химического типа относятся действия а) органических растворителей (ацетона, метилового, этилового и иных спиртов, пиридина, диоксана, эфира и др.) б) амидов, как например, мочевины, солей гуанидина, формамида, уретана и иных подобных веществ в) ионных детергентов, в частности анионных (алкил-сульфатов и т. п.) г) сали-цилата натрия и иных органических анионов, например трихлоруксусной кислоты д) минеральных солей, таких как СаС 2, Mg l2, K NS, которые при большой концентрации в растворе могут денатурировать белки е) солей тяжелых металлов. Кроме того, в качестве денатурирующих агентов обычно рассматривают протеазы, которые, по-видимому, могут вызывать денатурацию молекулы белка перед ее расщеплением. [c.160]