Определение зависимости скорости реакции от концентрации субстрата

Рис. 2.13. Определение К и по графику зависимости скорости реакции от концентрации субстрата.

Для большинства ферментов имеется определенное значение pH, при котором их активность максимальна выше и ниже этого значения их активность уменьшается. Для разных субстратов оптимум по pH может сдвигаться. Некоторые примеры приведены в табл. 6.9. Однако не во всех случаях кривые зависимости каталитической активности от pH имеют колоколообразную форму. Примером может служить инвертаза, катализирующая гидролиз сахарозы. Она сохраняет постоянную активность в интервале pH 3,0—7,5. С увеличением концентрации фермента скорость реакции увеличивается (см. уравнение [c.302]

Первая стадия. На первой стадии реакции фосфодиэстераза гидролизует 3, 5 -цАМФ до АМФ (6). Реакцию проводят в инкубационной среде, состоящей из 50 мМ трис-НС1 (pH 7,0), 10 мМ ацетата магния, цАМФ как субстрата реакции (концентрацию цАМФ выбирают в зависимости от целей эксперимента) и 0,3—0,4 мкКи ( Н)-цАМФ для определения скорости реакции по изменению концентрации радиоактивного изотопа в пробе. Дополнительно в соответствии с поставленной задачей инкубационная среда может содержать ЭГТА для определения активности фосфодиэстеразы свободной от кальмодулина или Са + и кальмодулина для активации фермента, различные комбинации концентрации Са +, кальмодулина и его антагонистов для определения действия последних на комплексе Са +—КМ—ФДЭ. [c.381]

Ферменты разрушаются в сильно кислых и сильно щелочных растворах и устойчивы только в определенных границах изменения активной реакции среды. В этих границах скорость катализируемой ферментом реакции различна при различных концентрациях ионов водорода [Н+], причем только при определенной [Н+] наблюдается наибольшая скорость реакции. Такая оптимальная концентрация ионов водорода отвечает наибольшей активности фермента. Оптимальная [Н+] не всегда одинакова для различных препаратов одного и того же фермента и изменяется иногда в зависимости от степени чистоты фермента. Кроме того, оптимальные концентрации ионов водорода двух ферментативных реакций с различными субстратами, но катализируемых одним и тем же ферментом, могут быть несколько отличными. [c.39]

В табл. 39 даны характеристики каталитических реакций для определения ванадия. В качестве восстановителей используют красители или ариламины, которые при окислении образуют интенсивно окрашенные продукты реакции. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата обычно имеет вид кривой с насыщением. Оптимальные концентрации субстратов-краси-телей составляют около 10 М, для других субстратов — 0,01—0,001 М (рис. 31). [c.109]

Для определения типа ингибирования и величины /С широко используется метод Диксона Скорость реакции измеряют при варьирующей концентрации ингибитора и постоянной концентрации субстрата. График зависимости J/vo от [I] представляет собой прямую Если [c.213]

Рис. 2. Способы графического определения величин Кт и Ущ по зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (объяснение см. в тексте)

При измерении убыли субстрата в данной ферментативной реакции в определенные промежутки времени получается ряд значений, лежащих на определенной кривой, которые выражают зависимость скорости реакции от времени. Это можно изобразить графически, откладывая на осях координат время и концентрацию. [c.218]

Применение холинэстераз для определения суперэкотоксикантов основано на зависимости скорости реакции К от концентрации субстрата [Л в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен [c.290]

Для определения оптимальной концентрации кофактора следует построить кривую зависимости скорости реакции от концентрации кофактора, аналогичную зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, и по этой кривой выбрать насыщающую концентрацию кофактора. [c.28]

М. Плато на кривой зависимости скорости реакции от концентрации субстрата для Мо, У, МЬ, Та не достигается даже при концентрации, близкой к насыщению (0,04 М). Оптимальные условия определения элементов по каталитической реакции окисления о-аминофенола приведены в табл. 7. Взаимное влияние элементов на правильность определения характеризуется данными табл. 8. Видно, что в оптимальных условиях определение каждого из указанных элементов можно проводить в присутствии 10—1000-кратных количеств посторонних переходных металлов. Предложенные методы определения использованы для анализа диоксидов кремния и циркония — сырьевых продуктов для оптических сред. [c.31]

Пропорциональная зависимость скорости реакции от концентрации субстрата наблюдается лишь при его низких концентрациях, затем постепенно прирост скорости реакции начинает отставать от роста концентрации субстрата, и в конце концов увеличение концентрации субстрата перестает вызывать возрастание скорости реакции. Скорость ферментативных реакций при высоких концентрациях субстрата приближается к определенному пределу, который называется максимальной скоростью - У ..у (рис. 3). [c.28]

Предстационарный подход. Наиболее прямое определение констант скоростей элементарных стадий реакции вытекает из анализа предстационарной кинетики реакции при определении характеристического времени [уравнение (2.75 )]. Из экспериментальных данных по образованию продуктов или промежуточных соединений могут быть найдены характеристические времена реакции [см., например, преобразование уравнения (2.72)]. Из зависимости X от концентрации субстрата можно найти элементарные константы скорости и [см. уравнение (2.75 ) и рис. 2.29]. [c.147]

Оптимальная температура ферментативных реакций. Скорость ферментативных реакций возрастает с увеличением температуры так же, как и скорость большинства реакций между ковалентными молекулами, согласно известному закону Вант-Гоффа, а именно возрастание температуры на 10° увеличивает скорость реакции в 1,5—3 раза. Однако этот рост наблюдается лишь при сравнительно низких температурах. Выше определенной оптимальной температуры, при которой скорость максимальна, она уменьшается, а при более высоких температурах реакция прекращается. Это явление объясняется тем, что при более высоких температурах ферменты дезактивируются за счет денатурации белковой компоненты. Большинство ферментов становится совершенно неактивным в интервале 50—80°. Оптимальная температура не может быть точно определена, так как она изменяется в широких пределах с изменением концентрации фермента, концентрации ионов водорода и в зависимости от присутствия различных примесей в ферментативном препарате или субстрате. [c.794]

Хотя погрешность в таких случаях очевидна, она может быть не столь велика, если для измерений скорости использовать точные приборы. Наиболее широко применяемый метод определения истинной начальной скорости состоит в том, что в течение короткого периода после смешивания фермента и субстрата проводят максимально возможное число определений концентраций субстрата или продукта реакции. При высоких концентрациях субстрата и благоприятном положении точки равновесия стационарное состояние сохраняется достаточно долго и линейный участок кривой позволяет точно определить начальную скорость реакции. При более низкой концентрации субстрата период линейной зависимости становится короче и в конце концов его совсем не удается обнаружить, вследствие чего возможны ошибки в вычислении начальной ско- [c.47]

В соответствии с уравнением (21-13) при постоянной концентрации фермента скорость реакции находится в линейной зависимости от концентрации субстрата при низких концентрациях его, поэтому определение скорости реакции методом фиксированного времени вполне приемлемо. Этими методами обычно и пользуются в химической лаборатории. При высоких концентрациях субстрата скорость реакции становится независимой от его концентрации (рис. 21-7). При определении концентрации фермента скорость реакции определяют методом фиксированной концентрации. [c.437]

Рис. 127. Кривая зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (а), соответствующая уравнению (8), и графические методы определения г ) ред и km б, в, г).

Скорость ферментативной реакции возрастает по мере увеличения кг [см. уравнение (21-11)] и уменьшения константы Михаэлиса. При постоянной концентрации субстрата скорость реакции находится в линейной зависимости от концентрации фермента в широких пределах концентраций (см. рис. 21-7). Если обе концентрации, и субстрата и фермента, постоянны, ферментативные реакции могут быть использованы для определения следовых количеств активаторов или ингибиторов с высокой специфичностью, свойственной ферментативным реакциям. В этом случае также наблюдается линейная зависимость до определенного верхнего предела концентрации. [c.437]

Чтобы по возможности избежать этих затруднений, при определениях активности обычно контролируют начальную скорость реакции, когда названные выше факторы еще не успели исказить ее течение. Определение ведут за короткие отрезки времени в начальной части кривой, когда обработке подверглось не более 20— 25% субстрата (см. рис. 8). В этих условиях можно получить линейную зависимость между скоростью процесса и количеством катализатора в реакционной смеси. Известны два основных способа изучения хода ферментных реакций отбор через некоторые промежутки времени отдельных проб и непрерывное наблюдение изменений в самой реакционной смеси. Во втором случае с помощью автоматической регистрации можно получать непрерывные кривые течения процесса. При исследовании отдельных проб определяют либо убыль (концентрацию) субстрата, либо накопление продуктов реакции. Первый из этих приемов даст более надежные результаты. [c.42]

Кинетика ферментативных реакций. Скорость реакций, катализируемых Ф., определенным образом завпсит от концентраций реагирующих веществ п условий среды. Характер этой зависимости определяется механизмом процесса. Общепринятым представлением об общем принципе действия Ф., независимо от конкретной природы Ф. и субстратов, является следующее. Фермент [Е] и субстрат [8] реагируют обратимо с образованием комплекса [ЕЗ], к-рый обладает более высокой реакционной способностью, чем исходный субстрат, и необратимо распадается с образованием продукта реакции (Р) и регенерацией исходного Ф. [c.207]

Гиперболический характер рассматриваемой зависимости имеет значение также и для практики. В частности, поскольку для определения содержания фермента в препарате обычно используют субстрат в высокой концентрации, на результаты не влияют небольшие ошибки при отмеривании раствора субстрата, а также случайное присутствие ингибиторов данного фермента. Действительно, начальная скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента при любой концентрации субстрата, за исключением крайнего случая, когда молярные концентрации субстрата и фермента по порядку величины близки. [c.41]

Разработана методика кинетических измерений, исключающая возможность термического и гидролитического разложения нитратов и нитритов в процессе подготовки проб и проведения анализа. Определение порядка реакции по субстрату показало переход значения от нулевого к дробному и далее к первому при увеличении концентрации азотной кислоты. Изучение влияния добавок позволило установить, что скорость сильно зависит от факторов, влияющих на равновесие автопротолиза азотной кислоты. В присутствии серной кислоты скорость резко увеличивается, тогда как добавление в реакционную смесь воды и нитрата калия приводит к резкому снижению начальной скорости. При этом происходит переход порядка реакции по субстрату т дробного к нулевому. Добавка нитрита калия вызьшает снижение скорости процесса. Реакция имеет первьт порядок по субстрату в области концентраций азотной кислоты 3.5-24.0 моль/л. Из-за значительного избытка азотной кислоты реализуется процесс псевдопервого порядка. Порядок по азотной кислоте определен по тангенсу угла наклона в координатах lgk ,фф- 1й[НКОз]. Константа скорости пропорциональна пятой степени концентрации азотной кислоты. Линейный характер зависимостей сохраняется для всего диапазона концентраций азотной кислоты, т е. высокий порядок по азотной кислоте не связан с влиянием растюрителя, а присущ собственно реакции нитроксилирования. [c.13]

Исследование зависимости скорости ферментативной реакции от таких условий, как концентрация субстрата, концентрация фермента, pH, температура, присутствие активаторов или ингибиторов может дать ценные сведения о строении и механизме действия ферментов. Измерение скоростей ферментативных реакций является также основой для определения и сравнения ферментативной активности разных препаратов и сравнения последней в условных единицах. [c.218]

Встречается и обратная ситуация, когда 5-образная кривая в присутствии аллостерического эффектора превращается в гиперболическую. Например, пируваткиназа скелетных мышц характеризуется кинетикой Михаэлиса, но в присутствии аллостерического ингибитора (фенилаланина) кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата становится 5-образной, при этом сродство фермента к субстрату (фосфоенолпирувату) уменьшается. Изменение кинетических свойств под действием аллостерических эффекторов обусловлено конформационной перестройкой молекулы белка. С помощью сшивающих реагентов или каких-либо других воздействий на структуру белка можно наблюдать потерю чувствительности фермента к аллосте-рическим эффекторам. Для выявления аллостерических свойств иногда необходимо изменить условия определения активности сместить pH реакционной среды в кислую или щелочную область от рН-оптимума или исследовать влияние эффектора при ненасыщенной концентрации субстрата. [c.215]

Определение кинетических параметров Кт и V) для ферментов с 5-образной кинетикой затруднено, так как кривые не линеаризуются в двойных обратных координатах. В случае положительной коопера-тивности кривые загибаются кверху, а при отрицательной — книзу. Экстраполяция прямого участка кривой до пересечения с осью абсцисс позволяет определить концентрацию субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной. Эту величину принято обозначать 5о,б. Для описания зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в случае аллостерических ферментов применяют преобразованное уравнение Хилла [c.215]

Кинетические исследования реакции эпоксидирования МОГ гидропероксидом проводилось при температурах (80---100)°С. Концентрация моноокиси и ГПТБ изменялась соответственно от 0,5 до 7,0 и от 0,25 до 1,5 моль/л. Количество катализатора резината молибдена составляло 6- 10 моль/л. Определение частных порядков по ГПТБ и катализатору показало зависимость, аналогичную эпоксидированию октадиена-1,7 [2]. Одиако, при определении частного порядка по МОГ наблюдается более сложная зависимость скорость реакции эпоксидирования при изменении копцентрации от 0,5 до 4,0 моль/л возрастает до максимума, а затем уменьшается по мере увеличения концентрации МОГ (рис. 2). Такая зависимость характерна для случаев ингибирования субстратом и наблюдалась ранее при эпоксидировании аллилового спирта [3]. Линейный характер зависимости 1 п = / [МОГ] ири малых концентрациях моноокиси свидетельствует о первом порядке реакции и по этому реагенту. С учетом того, что моноокись является субстра- [c.20]

Для определения типа ингибирования в рамках теории Миха-элиса — Ментен были сняты зависимости скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии различных концентраций ингибитора для ПГ и кофейной кислоты (КК). Соответствующие зависимости в координатах Лайниуивера — Бэрка приведены на рис. 2, Из данных рисунка получено значение Км для ксантина, равное 7 10 Д/, [c.148]

Многие теоретические представления в этой области базируются на аналогии между негиперболической зависимостью скорости реакции от концентрации субстрата в тех случаях, когда реакцию катализируют регуляторные ферменты, и сигмоидным характером зависимости связывания кислорода гемоглобином. Судя по тому, что рентгенограммы кристаллов гемоглобина и оксигемогло-бина имеют различный вид, связывание кислорода сопровождается определенным изменением конформации по аналогии возникло предположение, что механизм действия регуляторных ферментов также связан со структурными явлениями. Посмотрим, насколько удачна эта аналогия. [c.232]

Зависимость констант Михаэлиса кз и Км от pH мон ет быть весьма сло кной. Поэтому для исследования зависимости от pH србды требуется использование буферных растворов. При этом нередко оказывается, что между компонентами буферного раствора (особенно НРО ") и ферментом имеется определенное взаимодействие. Кроме того, влияние на активность белка и активность субстрата также оказывает ионная сила раствора, что еще в большей стенени усложняет интерпретацию процесса в буферном растворе. Этот факт не всегда принимался во внимание. Во всех уравнениях, применявшихся в этом разделе, концентрации должны быть заменены на активности. Когда концентрация субстрата меняется в широком диапазоне, то поправка на активность может быть весьма существенной. Например, изучение скорости реакции уреаза — мочевина в диапазоне концентрации мочевины от 0,0003 до 2,0 М показало, что при высоких концентрациях мочевины скорость реакции надает [112]. Это может быть связано с изменением активности, а не механизма реакции. [c.564]

Из зависимости стационарной скорости реакции от концентраций фермента, субстрата и продукта могут быть найдены лишь, 4 параметра ккат (5), ккзт(Р), К(5), К Р) — сложные функции элементарных констант. Видно, что при п > 1 определение всех элементарных констант скорости из данных по стационарной кинетике невозможно. [c.174]

Влияние pH на ферментативную активность иногда можно объяснить в рамках модели, предполагающей, что катализ зависит от состояния ионизации некоторых аминокислот. Тогда, если зависимость кат//См от pH описывается колоколообразной кривой, по ней можно определить константы ионизации Ки и К е каталитически важных групп в свободном ферменте. Константы ионизации, относящиеся к комплексу Е5, можно получить из зависимости кат от pH [101]. В случае КПА определение величин К е и Кге было бы полезным для установления роли тирозина и других остатков, расположенных вблизи субстрата. Однако имеющиеся данные довольно скудны. Пептидный субстрат КБЗ-01у-01у-РЬе был исследован недавно в условиях, при которых интерпретация результатов не осложняется ингибированием или активацией [7]. Кривые зависимости кат/-/См от pH оказались колоколообразными, что предполагает участие в катализе как кислой, так и основной групп. Кривые, описывающие влияние pH на кат, для этого субстрата имеют точку перегиба около pH 6. В щелочной области (до pH 10,5) кат практически постоянна . Отсутствие данных, указывающих на титрование второй группы в комплексе Е5, не исключает возможности участия в реакции кислотного катализа, если предположить, например, что соответствующая стадия не лимитирует скорость реакции (ср., однако, работу [103]). Зависимость гидролиза КГФ от pH представлена в нескольких ранних работах. Данные, полученные при высокой концентрации субстрата, указывают на с./южный характер влияния pH на кат и [26]. По зависимости начальной скорости от pH [104] были определены величины р/Се51 равные 6,5 и 8,6, однако сравнение с ацилтрипептидами показывает, что эти данные нуждаются в уточнении. При более низкой концентрации КГФ влияние pH на кат менее выражено [85]. [c.536]

В связи с тем, что скорость ферментативной реакции находится 8 определенной зависимости от концентрации фермента, то и для этой последней величины необходим такой же, как и для концентрации субстратов, способ выражения (т. е. гмоли на литр раствора). Однако в настоящее время это возможно далеко не для всех ферментов, поскольку немногие из них получены в индивидуальном состоянии и не во всех случаях надежно определен молекулярный вес ферментов. Помимо того, как оказалось, в одной молекуле фермента может содержаться несколько каталитических центров, и, следовательно, концентрация фермента может быть не равна концентрации каталитических центров. Все это осложняет положение, хотя в некоторых случаях молярную концентрацию каталитических центров удается определить при помощи прямых или косвенных методов (см. гл. IX) и использовать эту величину для вычисления кинетических констант. [c.9]

Ферменты-это белки, катализирующие строго определенные химические реакции. Они связываются с молекулой субстрата, в результате чего образуется промежуточный фермент-субстратный комплекс, который затем распадается на свободный фермент и продукт реакции. При повьппении концентрации субстрата 8 и постоянной концентрации фермента Е каталитическая активность последнего будет повьппаться до тех пор, пока не достигнет характерной для данного фермента максимальной скорости imax при которой практически весь фермент находится в форме комплекса Е8 и, следовательно, насьпцен субстратом. Такая зависимость между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции описывается гиперболича кой кривой. Концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину величины Р пах, получила название константы Михаэлиса-Ментен (Км). Эта константа является характеристикой каталитического действия фермента применительно к какому-то определенному субстрату. Уравнение Михаэлиса-Ментен [c.267]

Температура, с одной стороны, ускоряет саму ферментную (каталитическую) реакцию, в частности, все три последовательные стадии ее образование промежуточного комплекса фермента с субстратом, превращение его в комплекс фермент — продукт и, наконец, дисоциацию продукта. С другой стороны, она ускоряет денатурацию, т. е. разрушение, инактивацию ферментного белка. Таким образом, с повышением температуры при ферментных реакциях, как и вообще при химических процессах, растет реакционная способность, растет истинная каталитическая активность, т. е. скорость превращения субстрата. Но ферменты представляют собой белки, которые могут необратимо денатурироваться, причем скорость денатурации увеличивается при нагревании во много раз быстрее, чем скорость любого другого химического превращения. Поэтому противоположный процесс (инактивация), связанный с уменьшением концентрации фермента, обусловливает при дальнейшем подъеме температуры замедление реакции. Для ферментного действия характерно, что нагревание вначале приводит к увеличению скорости реакции, а затем, пройдя через определенный уровень,— к ее быстрому снижению. Если это изобразить графически, то на графике можно наблюдать кажущийся (ложный) температурный оптимум иными словами, при некоторой температуре действие фермента является максимальным. Температурный оптимум может изменяться в зависимости от условий реакции, состава системы, происхождения фермента. Известно, что энзимы, как и все другие белки, обладают различной термостабильностью, т. е. проявляют очень различную чувствительность к нагреванию. [c.47]

Константу Михаэлиса определяют следующим способом. Экспериментальные данные представляют в виде кривой, подобной той, которая показана ня рис. 10, По этому графику находят на оси абсцисс концентрацию субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной. Но величина Км определенная таким образом, является, естественно, неточной. Гораздо удобнее представлять опытные данные таким способом, чтобы график зависимости был дан в виде прямой. Подобный метод графического изображения разработали Лайнуивер и Бэрк (рис. И). Последнее из выведенных уравнений они преобразовали так [c.54]

Кинетические методы основаны на завнсимости скорости ферментативных реакций от концентрации субстратов и фермента, а также присутствующих в среде активаторов или ингибиторов. Если анализируемым веществом является субетрат ферментативной реакции, то для определения его концентрации не обязательно доводить реакцию до конца и достаточно определить любым методом начальную скорость реакции, к-рая при прочих равных условиях (концентрация фермента, второго субстрата, величина pH, темп-ра и т. д.) зависит от концентраций этого вещества. Характер этой зависимости определяется законами ферментативной кинетики (см. Ферменты, Михаэлиса константа), он может быть найден эмпирически п выражен в форме калибровочного графика, используемого для нахождения концентрации определяемого вещества по найденной экспериментально скоростп ферментативной реакции. Любой из приведенных выше прямых Ф. м. а. с участием одной ферментативной реакции может быть использован как кинетич. метод. Если же применяется комбинация из нескольких реакций, то скорость индикаторной реакции может служить мерой концентрации субстрата первой вспомогательной реакции в том случае, если предварительно эта реакция доводится до конца. [c.206]

Таким образом, при изучении гидрогеназы из данных стацио-, нарной кинетики яолучена интересная информация о механизме действия биокатализатора. Важно подчеркнуть этапы исследования экспериментальное изучение зависимости стационарной скорости реакции от концентрации субстратов и pH, построение, анализ и дискриминация кинетических моделей, определение численных значений констант скоростей и равновесий, построение энергетического профиля реакции и молекулярной модели активации водорода железо-серным кластером. [c.51]

Скорость ферментативной реакции находится в определенной зависимости от концентрации фермента и является мерой каталитического действия последнего. Она часто называется активностью и выражается в стандартных единицах. Комиссией по ферментам Международного биохимического союза за единицу количества фермента, обозначаемую символом Е, предложено принимать такое количество его, которое превращает 1 мкмоль субстрата или 1 мкэквивалент реагирующей группы или разрываемой связи в 1 мин при стандартных условиях. [c.220]

Для определения зависимости действия фермента от pH и концентрации субстрата был использован также кинетический анализ [59]. Как можно было ожидать из приведенных выше данных, константа Михаэлиса Кт значительно изменялась с изменением концентрации Мп2+. (Величина Кт представляет собой концентрацию субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимально возможной эта величина служит мерой сродства субстрата к ферменту.) Оптимум pH составлял 8,5 и не зависел от концентрации Мп2+ р/Са гипотетического активного центра фермента был равен 7,2, т. е. был таким же, как у ацетилхолинэстеразы. Маунтер считает, что оба фермента содержат в своем активном центре гистидин. [c.143]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология