Применение ГЖХ для анализа последовательности аминокислот

Область применения. Препаративное разделение пептидов, анализ последовательности аминокислот в полипептидах и белках. [c.197]

В случае применения подобной методики для анализа последовательности аминокислот необходима идентификация разделенных соединений, однако возможности ГХ в, данном случае довольно ограничены. Кроме того, что необходимы колонки различной избирательности, нужно знать и относительные удерживаемые объемы исследуемых соединений. Идентификация непосредственно зависит также от доступности подходящего стандарта. Если дипептиды можно синтезировать химически, то для более длинных пептидов это очень трудная задача. Применение ГХ только в целях разделения оправдано лишь тогда, когда выделенные пептидные производные можно уверенно идентифицировать и определить их последовательность с помощью других методов. [c.338]

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определения последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмотрена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы - определение последовательности аминокислот в белковой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого гена . [c.56]

Важнейшим этапом в выяснении структуры полипептидов и белков является определение последовательности аминокислот. Не считая применения масс-спектрометрии для решения этой проблемы [14] (см. кн. I гл. 5), основным методом определения последовательности аминокислот является анализ концевых групп он состоит в определении аминных и карбоксильных концевых групп. Для решения этой задачи были разработаны различные химические и ферментативные методы. [c.402]

В то время как главные достижения в структурном анализе белка обязаны методу N-концевого отщепления аминокислот по Эдману, а применение автоматических секвенаторов позволило определить протяженные (40—70 остатков) последовательности аминокислот, структурный анализ белков с С-конца до сих пор находится в неудовлетворительном состоянии. Несмотря на бесспорную необходимость решения этой проблемы и большие усилия в этом направлении, ощутимых успехов пока не достигнуто. [c.481]

Надежные методы С-концевого анализа необходимы не только для определения ограниченных последовательностей аминокислот отдельных пептидов. Для широкого применения быстрых методов определения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, все чаще и сильнее ощущается потребность в знании как N-, так и С-концевых последовательностей соответствующих белков. Такие данные необходимы для правильного расположения инициирующего кодона и счи- [c.481]

Первичной структурой полимера, состоящего из различных мономеров, является последовательность ковалентно связанных мономеров, например последовательность аминокислот в белке или последовательность нуклеотидов в полинуклеотиде. Первичная структура полимера может быть определена путем химического анализа с применением большого числа методов разделения, описанных в гл. 8 и 9. Однако сами химические методы в данной книге не будут рассмотрены. [c.16]

Использование этих стандартных спектров КД для подсчета соотношений а-спирали, -формы и неупорядоченных конформаций глобулярных белков с попыткой воссоздания экспериментально измеренного спектра КД белка по алгебраической сумме различных долей спектра из трех чистых конформаций стало главным применением этого спектроскопического метода в данной области. Достигаемая при этом точность зависит от того, насколько конформационно чистым является стандарт, и для этой цели были рекомендованы и несколько поли ( -аминокислот). Неопределенностью, однако, является то, в каких условиях эти поли (аминокислоты) становятся полностью конформационно неупорядоченными. В качестве стандарта с неупорядоченной конформацией предложен поли ( -серин) при высоких солевых концентрациях [23]. КД-спектры, вычисленные для миоглобина, лизоцима и рибонуклеазы на основе их третичных структур, которые ранее были установлены для этих глобулярных белков по данным рентгеноструктурного анализа, согласуются по всем характеристическим точкам с экспериментальными спектрами КД при использовании в качестве одного из стандартов поли ( -серина) [35]. Подобные данные по анализу соответствия кривых по нативным белкам и полипептидам многочисленны, и они дают информацию о степени конформационной упорядоченности этих веществ в растворах [36]. Эти данные не дают, конечно, ответа на вопрос, какая именно часть первичной структуры а-спирализована, какая отвечает -форме и какая— неупорядоченной, однако основываясь на последовательности аминокислотных остатков белка или полипептида, можно строить рискованные предположения о том, где эти конформации локализованы. Как отмечалось в разд. 23.7.2.4, аминокислоты белков разделяются на те, которые при включении в полипептиды способствуют принятию упорядоченной конформации, и те, которые тому не способствуют. Такая информация получена при рассмотрении [c.437]

Хроматография производных аминокислот получила интенсивное развитие в связи с разработкой методов определения первичной структуры белков. Вероятно, трудно найти в органической химии и биохимии более удачный пример столь тесной взаимосвязи развития представлений о структуре и функциях большого класса веществ, каким являются белки, с хроматографическими методами анализа. Основное внимание было направлено на разработку методов определения N-концевых остатков аминокислот в белках, причем в идентификации соответствующих производных большое значение имели тонкослойная (ТСХ) и бумажная хроматография (БХ) (см. обзоры [1, 2]). Газожидкостная и жидкостная колоночная хроматографии находят в этой области ограниченное применение, однако интерес к последнему методу постепенно растет. Интерес к жидкостной хроматографий вызван вполне определенными причинами. Во-первых, постоянно появляются новые методы избирательной модификации остатков аминокислот в белках, а идентификация производных аминокислот требует развития хроматографических методов. Во-вторых, исследованию подвергают все более труднодоступные белки, что в свою очередь вызывает необходимость создания надежных методов количественного анализа. Интерес к колоночной хроматографии возрастает также в связи с выделением и получением необычных аминокислот, а также в связи с необходимостью предотвращения ошибок при определении аминокислотной последовательности. Понятия современный и классический метод используют здесь условно, поскольку новые методики обычно создают на базе стандартной аппаратуры примером может служить автоматический анализ ДНФ- и ДНС-аминокис-лот [3, 4]. Насколько известно, до сих пор не пытались использовать скоростную хроматографию высокого разрешения для разделения производных аминокислот, хотя некоторые соединения, например ДНС-аминокислоты, являются для этого метода довольно удобным объектом. Производные аминокислот использовали в структурном анализе белков крайне неравномерно. По-видимому, всеобщее увлечение ДНФ-аминокислотами проходит окончательно, уступая место повышенному интересу [c.360]

Взаимодействие растворимых веществ с сорбентами обычно изучается с целью создания сорбционных методов разделения смесей веществ. Вторая возможная область применения этого явления заключается в использовании сорбции для изучения свойств сорбируемых молекул. Это направление успешно развивается и уже в настоящее время позволяет определять эквивалентный вес сорбата, число зарядов в молекуле, оценивать молекулярный вес. Особенно важен сорбционный метод для изучения ряда свойств макромолекул. Он является важным дополнением к гидродинамическим методам анализа размеров и формы молекул глобулярных белков. Наряду с этим изучение электрохимических свойств макромолекул сорбционными методами позволяет получить ряд дополнительных сведений по сравнению с результатами потенциометрического титрования. Естественно, что для развития теории сорбции макромолекул необходимо предварительно изучить сорбцию низкомолекулярных веществ аналогичного типа. В связи с этим здесь последовательно рассматривается сорбция аминокислот, пептидов и белков. Изучение законов сорбции этих групп веществ может быть использовано также для их разделения как на основе одноактных сорбционных, так и хроматографических методов. [c.187]

Для успешного применения этого подхода к анализу последовательности аминокислот необходимо найти такие тиоацилирующие агенты и условия проведения процесса, которые по своей эффективности на стадии конденсации с пептидом не уступали бы ФИТЦ. Использовались реагенты общего вида R ( S)—X, где К — алкильный или арильный (ароматический компонент), X — активирующая уходящая группа, например ——РК, —Тиоацилхлориды (Х = С1) обладают высокой реакционной способностью, но они слишком неустойчивы. Тиоацилирующая способность увеличивается по мере увеличения электронооттягивающей силы ацильного заместителя К. Но эта тенденция сопровождается снижением скорости реакции циклизации, так что при выборе подходящего реаген та для конденсации с пептидом должен соблюдаться компро мисс, помогающий эффективно проводить обе стадии цикла Опробовано большое число соединений наиболее перспектив ные реагенты для последовательного отщепления аминокислот указаны в табл. 16.1. Наличие зарядов на уходящих группах (соединения 1, 6 и 7) чрезвычайно облегчает растворимость реагентов в водноорганических средах, хотя в анализе можно без осложнений использовать системы из безводных растворителей и незаряженных реагентов. [c.453]

В последнее время постоянно увеличивается. применение ВЭЖХ в анализе последовательности аминокислот на микроуровне (гл. 6). Это позволяет выделить микрограммовые количества пептидов в виде растворов, пригодных для прямого нанесения в реактор секвенатора [112]. Важным дополнительным методом анализа коротких пептидов является масс-спектромет-рия [12, 60, 73] чрезвычайно высокая чувствительность этого метода может способствовать его широкому предпочтительному распространению. [c.459]

Количественный анализ аминокислот методом ГХ представляет несомненный интерес. Как правило, количественное определение аминокислотного состава пептида является одним из решающих моментов анализа последовательности. Поскольку при деградации крупного белка образуется большое число фрагментов, желательно затрачивать на анализ каждого из них минимальное количество времени и вещества. Привлечение в данном случае ГХ достаточно хорошо удовлетворяет этим условиям. Многочисленные исследования по ГХ аминокислот в конечном итоге направлены на решение этой задачи. Однако к действительно эффективному количественному методу предъявляются несоизмеримо более высокие требования, чем к качественному. Если учесть к тому же трудности получения и разделения производных аминокислот, станет ясно, почему до сих пор не разработан стандартный метод их количественного определения с помощью газового хроматографа. Основные трудности связаны, как подчеркивалось в разделе о получении производных, с полифункциональными аминокислотами. Метод, игнорирующий их идентификацию, может найти лишь ограниченное применение. Количественный анализ только простых аминокислот не может удовлетворять экспериментатора [40]. Вопрос о том, все ли аминокислоты, встречающиеся в белках, можно определять ГХ с достаточной точностью, все еще остается открытым. Здссь можно только вкратце рассмотреть имеющиеся условия и возможности. Проблемы, связанные с аппаратурой, необходимой для количественной ГХ, уже обсуждались ранее (см. стр. 302). [c.335]

Основное внимание мы будем уделять тем белкам, структура которых в ативном состоянии была (расшифровала с 1по мощью рентгеноструктурного анализа лизоциму, рибонуклеазе, миоглоби-ну, гемоглобину и инсулину. Некоторое внимание будет уделено трипсину, химотрипсину и их предшественникам, а также цитохрому, для которых структура известна частично или, по крайней мере, определена последовательность аминокислот. В основном исследования выполнялись с помощью протонного магнитного резонанса, но ограниченное применение в специальных исследованиях получил и ЯМР других ядер ( Р, Р, и др.). [c.348]

Вследствие относительно высокой упругости паров соединений, содержащих фтор [50], газо-жидкостная хроматография применяется для разделения К-ТФА-эфиров ди-, три- и тетрапептидов, Газо-хроматографический анализ различных летучих производных коротких пептидов проводился рядом автором [51—56]. Бименом и Веттером, например, осуществлено хроматографическое разделение N-aцeтилиpoвaнныx аминоспиртов и полиаминов, полученных из лейцил-аланина, глицил-фенилаланина, фе-нилаланил-глицина, лейцил-аланил-пролина и лейцил-аланил-глицил-лейцина с последующим масс-спектрометрическим определением последовательности аминокислот в пептидных цепях [53]. Однако наибольшего успеха удалось достигнуть при применении, как и в случае разделения аминокислот, К-трифторацетилирован-ных метиловых эфиров (рис. 9). Указанный метод, по-видимому, имеет ограниченное применение при исследовании структуры пептидов [64] и степени рацемизации при их синтезе [55]. [c.267]

Первое направление является логическим развитием и, даже можно сказать, завершением основного органохимического направления исследований белковых веществ, а исследования конфигурации белковых веществ начались в результате применения метода дифракции рентгеновских лучей для исследования структуры белков, аминокислот и пептидов. Первоначально, в 30-х годах в обоих этих направлениях преследовалась общая цель — выяснить основные принципы строения белковых веществ. Но по мере того, как начинает выясняться важная роль пространственной организации белковой частицы для проявления ее основных функций, рентгеноструктурный анализ постепенно занимает центральное положение среди мето ов, которые могут дать полную информацию не только о последовательности аминокислот в цепи, но в первую очередь о пространственной конфигурации (третичная структура) образующихся сложных соединений. [c.138]

К сожалению, большинство работ по цитохрому с проведено на высших организмах. Бактериями, особенно интересными с точки зрения биоэнергетики, в основном пренебрегают. По-видимому, частично это происходит потому, что не всегда ясно, какой цитохром определенной бактерии соответствует цитохрому с высших организмов. Другие упомянутые выше белки даже не встречаются у бактерий. Только недавно метод выяснения последовательности аминокислот в цитохроме с был применен к фотосинтезирующей бактерии RhodospirШит rubrum, а выяснение последовательности нуклеотидов тРНК было проведено на других бактериях [1237]. Возможно, самым важным объектом анализа последовательности для филогении окажется древний белок ферредоксин (7, Г), который, видимо, есть у всех организмов [341, 449, 450, 527, 773—777, 1158, 1988]. [c.31]

Примером использования радиоактивно меченных реагентов служит работа [54]. В каждом цикле отщепления белок обрабатывают сначала [ 5]ФИТЦ, затем холодным ФИТЦ. Этим методом удалось установить последовательность -- 20 аминокислот, израсходовав 5—15 пмоль белка. В разд. 16.2.4.4 рассмотрено применение этого подхода в ТФ-анализе последовательности [17, 18]. Недостатком метода, как в случае ЖФ, так и в случае обычного ТФ-ссквенатора, является большой расход реагента, необходимый для того, чтобы покрыть большую площадь поверхности реактора секвенатора. Это в свою очередь ведет к высокому уровню радиоактивного фона в анализе очень малых количеств образца и делает сам анализ н дорогим, и опасным. [c.459]

Для биосинтетического маркирования белков можно использовать также предшественники, меченные другими изотопами. Среди них S-метионин имеет преимущество перед соединениями, содержащими тритий применение этого вещества более удобно для простого радиоавтографического анализа очищенных продук- тов (Laskey, Mills, 1975). Кроме того, имеются препараты меченого метионина с высокой удельной активностью. Однако, учитывая эти преимущества, важно иметь в виду, что большинство белков содержит относительно мало метиониновых остатков. Чтобы получить материал для определения последовательности аминокислот в белках, Бэллоу и сотр. (Ballou et al., 1976) разработали метод одновременного включения всех 20 аминокислот, меченных С, в одной клеточной культуре. Этим авторам удалось частично расшифровать последовательность аминокислот в антигенах гистосовместимости, получив достаточную активность с помощью С-аминокислот и С-пирувата. [c.184]

К реакционной газовой хроматографии (в смысле определения Драверта и сотр.) должен быть отнесен также метод, разработанный Златкисом и сотр. (1958, 1960) для прямого определения алифатических аминокислот в водном растворе при применении двух реакторов (см. разд. 8.1.2). В нагреваемом до 140° реакторе I, заполненном нингидрином, сначала происходит окислительное разложение аминокислот до летучих альдегидов и двуокиси углерода. Продукты реакции разделяются в присоединенной последовательно колонке при комнатной температуре и переводятся в реактор II, заполненный никелем на кизельгуре. Это заполнение обеспечивает при 425° гидрогениза-ционное расщепление всех альдегидов до метана. Присоединяемая к реактору II короткая колонка с молекулярными ситами служит для абсорбции образующейся и захваченной из пробы воды. Отдельные аминокислоты затем определяются в виде пиков метана при помощи катарометра. Применением реактора II решается относительно простая задача газохроматографического анализа веществ, содержащих воду, тем более что метан в отличие от альдегидов легко высушить. Кроме того, превращение альдегидов в метан позволяет более просто количественно определять аминокислоты, так как специфическая для данных веществ теплопроводность остается всегда одинаковой и вследствие этого не нужно вводить поправочных коэффициентов в количественные результаты. Тот факт, что катарометр при обычной температуре может применяться для определения метана, положительно сказывается на чувствительности метода. [c.274]

Для разделения полиаминов наиболее пригодным ионитом, по-видимому, является биорекс 70 (400 меш). Применение его описано в нескольких статьях [4, 6, 7]. Колонки (7X0,9 см) с этим сорбентом присоединяются к обычному прибору для автоматического анализа аминокислот. Элюирование осуществляют со скоростью 2 мл/мин последовательно несколькими буферными растворами. Первый буферный раствор представляет собой 0,438 М раствор ацетата натрия с pH 7,5. После того как 100 мл первого раствора пройдет через колонку, его немедленно заменяют вторым буферным раствором, представляющим собой 0,5 М раствор ацетата пиридина с pH 4,4. Времена удерживания полиаминов в указанной выше системе опубликованы в работе [8]. Способ Морриса [9] предусматривает внесение небольших изменений в состав буферных растворов. После введения пробы в колонку смолу начинают промывать первым буфером (0,33 М раствором ацетата пиридина с pH 5,7). После того как через колонку пройдет 100 мл первого буфера, промывание продолжают вторым буфером (0,38 М раствор ацетата натрия с pH 4,4) [c.270]

За последнее десятилетие возможности применения рентгеновского анализа значительно возросли. Около десяти лет тому назад была закончена работа Ходжкин с сотрудниками по бензилпени-циллину это был один из первых примеров использования данного физического метода для решения трудной стереохимической проблемы. К 1956 г. в той же лаборатории было установлено строение витамина В12, а в настоящее время с помощью рентгеновского анализа Кендрью с сотрудниками определяют последовательность соединения аминокислот в глобулярном протеине — миоглобине. За то же время стандартное отклонение при определении этим методом длин связей в сравнительно простых молекулах было уменьшено в десять раз — до нескольких тысячных ангстрема. Огромную пользу принесло развитие вычислительной техники вероятно, что с развитием полностью автоматизированных методов измерений будут вскоре преодолены и другие препятствия. Тем не менее, определение кристаллической структуры останется, вероятно, длительным процессом, требующим в сложных случаях до десяти и более лет работы в расчете на одного человека. [c.176]

В книге достаточно детально рассмотрены основные преимущества и недостатки классического метода определения аминокислотного состава белков с помощью ионообменной хроматографии по Муру и Стейну даны указания относительно выбора ионообменников, подготовки реактивов и численной интерпретации результатов. Значительное место также уделено изложению принципов анализа аминокислот методом газожидкостной хроматографии. Применение этого метода, обладающего на 2—3 порядка большей чувствительностью по сравнению с нингидринной реакцией по Муру и Стейну, позволяет значительно снизить количества белка, требуемые для определения его состава. Анализ аминокислот с помощью газожидкостной хроматографии пока еще не находит широкого применения, однако имеющиеся в ли-Фературе данные позволяют считать этот метод весьма перспективным. Кроме того, обсуждаются возможности использования газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектромет-рией для определения состава и аминокислотной последовательности в пептидах. [c.4]

В термометрическом титровании могут быть использованы реакции кислотно-основного взаимодействия, окисления —восстановления и любые другие, тепловые эффекты которых достаточно велики, чтобы произвести точные измерения. Важным достижением термометрических методов является возможность прямого титрования слабых кислот с высокой точностью. Например, борная кислота титруется в водном растворе без добавления манни-та. Также могут быть оттитрованы некоторые слабые органические кислоты, аминокислоты, слабые основания и другие вещества. Термометрическое титрование различных восстановителей дихроматом показывает более высокую точность, чем титрование с применением дифениламина в качестве индикатора. Известны методы термометрического титрования, основанные на реакциях осаждения сульфатов, галогенидов, оксалатов и других малорастворимых соединений, методы, основанные на образовании этилендиаминтетраацетатных и других комплексов и т. д. Разработаны методы анализа смесей путем последовательного титрования компонентов без предварительного химического разделения. Термометрическим методом титруются также различные вещества в неводных растворителях (ледяная уксусная кислота, ацетонитрил и др.) и в расплавах солей, например в расплавленной эвтектике нитритов лития и калия аргентометрически титруется хлорид. [c.296]

Применение динитрофенильных производных, введенных в практику Зангером [25] с целью идентификации и количественного определения концевых аминогрупп, позволяет получить ценные сведения о количестве открытых цепей в белке. Кроме того, такие меченые аминокислоты служат в качестве реперных точек при исследовании неполного гидролиза (1346). В этом отношении полезными являются также е -аминогруппы лизина. Путем неполного гидролиза, осуществляемого с помощью кислоты и различных типов ферментов, оказалось возможным разрывать длинные полипептидные цепи в различных точках и путем анализа установить единственно возможную конфигурацию. Этим способом Зангер и Таппи[99]и Зангер и Томпсон [100] определили порядок чередования аминокислот в двух типах цепей, входящих в состав инсулина (табл. 27). Такой подход к проблеме структуры белка был облегчен широким применением новейших микрометодов хроматографии на бумаге и силикагеле и ионофореза. Таким образом, оказывается, что одна из крупнейших проблем химии белка поддается изучению с помощью весьма простых и экономичных методов. Цепи в инсулине имеют различную длину, причем цепь с N-концевым фенилаланином (цепь В) состоит из 30 остатков, а соответствующая глициновая цепь (цепь А) — из 21 остатка. Порядок чередования аминокислот и их содержание даны в табл. 27. Можно отметить следующее. Цепь А не содержит лизина, гистидина, аргинина, треонина, фенилаланина и пролина все эти компоненты входят в состав цепи В, в которой, в свою очередь, совсем нет изолейцина. Не наблюдается ни регулярного чередования аминокислот, ни тенденции к чередованию полярных и неполярных групп. Три ароматические аминокислоты (фен.фен.тир.) расположены последовательно, и два остатка глутаминовой кислоты связаны с двумя остатками ци-стеина (глу.глу.цис.цис.). В обеих цепях содержится шесть цистеиновых остатков, четыре из которых расположены врозь, а только что упомянутые два — рядом друг с другом в молекуле нативного белка все они существуют в форме цистина, но какие из них расположены между пептидными цепями, а какие в самих пептидных цепях — неизвестно. Часть дикарбоновых кислот присутствует в виде амидов — четыре в цепи А и две в цепи В. [c.255]

Чтобы способствовать развитию мышления студентов и привить им интерес к работе, в книгу включено большее коли- 1ество эксперилщнтальных задач и исследований неизвестных соединений. Для идентификации компонентов бинарных сме- сей и определения их соотношения описана фракционная перегонка с применением доступной, но эффективно набивки для колонки. Идентификация неизвестных веществ включена в опыты, посвященные изучению карбонильных соединений, аминов, аминокислот и сахаров, и в главу о качественном анализе. Техника измерения твердых и жидких веществ в количестве нескольких миллиграммов, с помощью обычных весов и тинейки, позволяет производить определение молекуляр Юго веса по Расту, определение соотношения между количество.м угля, применяемого для обесцвечивания, и адсорбированного им вещества, а также получать производные различных веществ в количестве нескольких миллимолей. Последовательность расположения синтетических работ, различные пути и приемы их проведения рассчитаны на проявление инициативы студентов. [c.17]

ТОК метода состоит в том, что иптепсивпость окрашивания различна для разных белков, причем эти различия могут достигать трехкратной величины. Для точных анализов необходимо поэтому строить калибровочный график по тому белку, который требуется определять, и нельзя пользоваться, как это часто делают, удобным, но произвольным стандартом типа сывороточного альбумина быка. Готтшалк [70] считает, что калибровка с помощью белкового компонента гликопротеинов неосуществима и это делает невозможным применение обсуждаемого метода для точных определений. Структурные особенности белка, определяющие интенсивность окраски, сложны и включают не только содержание тирозина и триптофана, но и последовательность некоторых аминокислот с функциональными группами в боковой цепи, особенно гистидина, аргинина и глутаминовой кислоты 1123]. Можно ожидать, что различие в содержании тирозина во фракциях гликопротеинов само по себе может давать ошибочные результаты [121]. [c.151]

Смотреть страницы где упоминается термин Применение ГЖХ для анализа последовательности аминокислот: [c.91] [c.277] [c.253] [c.267] [c.459] [c.464] [c.488] [c.693] [c.41] [c.61] [c.439] [c.242] [c.267] [c.677] [c.174] [c.174] [c.179] [c.419] [c.451]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология