Седиментация центрифугирование в градиенте

Метод центрифугирования в градиенте плотности имеет две разновидности метод, основанный на измерении скорости седиментации в градиенте сахарозы, и метод равновесного центрифугирования, в котором используется градиент хлористого цезия. В первом варианте используется заранее приготовленный градиент, а во втором — градиент создается под действием поля центробежных сил непосредственно в ходе эксперимента. [c.417]

Фиг. 205. Кривая седиментации в градиенте плотности сахарозы рибосом, выделенных из ретикулоцитов кролика так же, как описано в подписи к фиг. 203, но подвергну-"ых перед центрифугированием краткой обработке рибонуклеазой.

В этом разделе кратко рассматриваются методы работы, используемые для выделения ферментов, структурно связанных с нерастворимыми компонентами клетки, такими, как митохондрии, хлоропласты, плазмалемма, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Эти методы не применяются к водорастворимым ферментам, заключенным внутри органелл, например к белкам митохондриального матрикса, а лишь к ферментам, ковалентно связанным или прочно ассоциированным с частицами. Существенной степени очистки по сравнению с исходным материалом можно добиться, многократно промывая гомогенат буфером, в котором данный фермент не растворяется. После этого возможны два подхода к решению проблемы. Можно фракционировать осадок методом дифференциального центрифугирования (седиментация или градиент плотности), с помощью электрофореза или молекулярных сит . [c.52]

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов достаточно кратковременного последовательного центрифугирования при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорением) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положеиие каждой фракции и содержание в ней РНК. [c.163]

Мочевина или гуанидингидрохлорид вызывают обратимую диссоциацию р-галактозидазы на четыре компонента, которые, судя по измерениям диффузии и седиментации, должны быть одинаковыми по размеру (М компонента около 130 000, а М нативного фермента 518 000) [79]. Были получены гибриды легких молекул этого белка ( С, Ы) и тяжелых молекул ( С, Н) й сопоставлены их плотности при центрифугировании в градиенте [c.402]

После импульсной метки и центрифугирования в градиенте плотности были получены, как и предполагалось, три пика, поглощающие ультрафиолет при 260 ммк. Пики эти соответствовали 233- и 168-рибосомам и 43-5-РНК и не содержали метки. Пик радиоактивности соответствует фракции, содержащей молекулы с коэффициентом седиментации между 48 и 168 (фиг. 83). Однако количество вещества в этой фракции слишком мало, чтобы его можно было определять путем измерения оптической плотности этот пик соответствует т-РНК. [c.242]

Центрифугирование в градиенте плотности. Конвекционные возмущения и взаимодействие между молекулами растворенного вещества сводятся к минимуму или совершенно исключаются, если центрифугирование проводят в непрерывном градиенте плотности. Существует два метода этого типа метод, основанный на измерении скорости седиментации, и метод седиментационного равновесия. [c.138]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Четко разграниченные пики, приведенные на фиг. 7, А, соответствуют полисомам, коэффициенты седиментации которых свидетельствуют о том, что они содержат одну, две, три, четыре и т. д. рибосом. В свою очередь центрифугирование в градиенте плотности сахарозы позволяет отделить 808-частицы от более тяжелых и более гетерогенных полисом (фиг. 7, Б). [c.26]

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров [1, 2, 4, 12] включает в себя три следующих экспериментальных метода скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) — ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца. Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) — молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения. Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это — широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей. [c.14]

В последнее время разработан метод центрифугирования в градиенте плотности, с успехом использованный для разделения нуклеиновых кислот. По этому методу центрифугируют смешанный раствор высокомолекулярного и низкомолекулярного веществ. При больших угловых скоростях вследствие седиментации низкомолекулярного вещества на разных уровнях устанавливаются различные плотности раствора. Если молекулы высокомолекулярного соединения находятся в точках с плотностью раствора, большей их собственной плотности, то они перемещаются к оси вра- [c.49]

Мол. веса с помощью ультрацентрифуг определяются тремя методами методом определения скорости седиментации, методом седиментационного равновесия и методом центрифугирования в градиенте плотности. [c.409]

Рис. 290. Иллюстрация области плато при центрифугировании в градиенте плотности в предположении, что градиент плотности был установлен до того, как произошла I заметная седиментация полимера.

Метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности [115, 1Щ. Когда при центрифугировании в градиенте плотности достигается седи-ментационное равповесие, концентрации макромолекул распределяются но гауссову закону ширина полосы седиментации определяется двумя противоположно действующими факторами — тенденцией макромолекул диффундировать в область более низких концентраций и их стремлением седиментировать в зону с соответствующей плотностью. Было показано, что в такой системе приближенное значение молекулярного веса может быть определено по следующей формуле [c.240]

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске, но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 - / о/р станет равным нулю и дальнейшая седиментация прекратится, т.е. возникнет устойчивая зона нахождения биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера репликации ДНК приведен в 5.1. [c.244]

Особым случаем равновесного центрифугирования является седиментация при градиенте плотности [14, 76, 135], для которой применяют двухкомпонентные системы растворителей. Градиент плотности возникает вследствие седиментационного разделения составных частей растворителя вещества с различной плотностью распределяются в различных точках, где их эффективная плотность равна плотности окружающей среды. Вследствие диффузии в этих полосах накопления зависимость с от г в идеальном случае подчиняется закону Гаусса. Чаще всего этот метод применяли для исследования нуклеиновых кислот, но можно получить распределение в градиенте плотности и для полимеров умеренного молекулярного веса, если в качестве растворителей брать смеси 1,2-дибром-1,2-дифторэтана с циклогексаном и использовать оптическую шлирен-систему [221. Другая система описана Бреслером и сотр. [30]. Сведения о распределении сополимеров по составу можно получить также путем измерения рассеяния света[33]. [c.61]

Метод седиментации в градиенте плотности СзС1 применяют, в частности, для разделения Н - и М -ДНК. В результате центрифугирования получают два отдельных пика, соответствующих разности в плотностях, равной всего 0,014 г/см . Относительные количества ДНК каждого типа определяют посредством фотографирования в ультрафиолете (интенсивность поглощения рассчитывают по степени почернения фотопластинки). Метод седиментации в градиенте плотности позволяет также изучать нуклеотидный состав ДНК из разных источников, поскольку различия в нуклеотидном составе приводят к различиям в плотности. (Препараты ДНК, содержащие большое количество пар гуанин — цитозин, обладают более высокой плотностью, чем препараты с высоким содержанием аденина и тимина.) Эти работы будут рассмотрены более подробно в разд. 3 и 4 гл. ХУП1. Применение описанного метода к белкам встречает ряд затруднений, связанных с тем, что молекулярный вес белков составляет всего 1% от молекулярного веса ДНК и они образуют в растворах с таким же градиентом плотности очень широкие полосы (в 10 раз шире, чем ДНК). Такая полоса может занять всю ячейку. Осаждение белков с помощью сульфата аммония, добавляемого в небольших количествах, позволяет заметно сузить полосы. [c.196]

Чтобы преодолеть эту трудность, необходимо создать градиент плотности. Это можно осуществить и в умеренно разбавленных солевых растворах, применяемых в аналитическом ультрацентрифугировании, если исследуемый материал первоначально находится в более разбавленном растворе. Когда слой с исследуемым материалом нанесен на поверхность основного объема растворителя, из-за быстрой диффузии малых молекул образуется пологий градиент плотности (рис. 11.16, Б). Перепад плотности от мениска до дна ячейки может составлять всего так что это почти не влияет на скорости седиментации. При центрифугировании градиент остается стабильным (и даже увеличивается), поскольку молекулы соли имеют ббльшую, чем у воды, плотность. Большие силы в ультрацентрифуге могут влиять даже на небольшие ионы. Однако градиенты в разбавленных солевых растворах недостаточно стабильны вне центрифуги. Бели вы захотели бы извлечь очищенный материал соответствующей зоны, вам пришлось бы отсасывать его, пока ротор еще крутится. Это возможно, но в большинстве случаев существует более простое решение. [c.250]

Еще один метод разделения органелл основан на равновесном (изопикническом) центрифугировании в градиенте плотности. Полученный из листьев экстракт наслаивают иа градиент концентрации сахарозы и затем центрифугируют до тех пор, пока органеллы не достигнут равновесного положения в градиенте в соответствии с нх плавучей плотностью. Разделение оргаиелл в данном случае основано ие на различии в скорости нх седиментации, а на различии в их плотности. Пероксисомы имеют более высокую плавучую плотность, чем интактные хлоро-лласты, а интактные хлоропласты имеют более высокую плавучую плотность, чем интактные митохондрии. Обычно полученные из листьев экстракты наслаивают на градиент концентрации сахарозы (примерно 20—60% по весу), который затем центрифугируют в роторе с подвесными стаканами в течение 3—4 ч при 100 000 g. Равновесное положение пероксисом достигается при Ллотности 1,25, интактных хлоропластов — при плотности 1,20—1,22, а митохондрий — при плотности 1,18—1,20. Бо- лее высокая плавучая плотность пероксисом может быть юбусловлена тем, что они частично проницаемы для сахарозы. После центрифугирования градиент делят иа фракции (объемом около 1 мл весь объем стакана обычно составляет [c.416]

Рис. 5-28. Отделение полирибосом от свободных рибосом(и отих субъединиц) с помощъю центрифугирования. Метод основан натом, что крупные молекулярные агрегаты движутся в сильном гравитационном поле быстрее, нежели мелкие. Обычно седиментацию проводятв градиенте сахарозы, чтобы стабилизировать раствор - предотвратить его перемешивание за счет конвекции.

Седиментация под влиянием центрифугирования происходит при скорости, зависящей от размера капель эмульсии. Пинтер и Зильвесмит (1962) фракционировали эмульсии М/В по размерам частиц седиментацией в колонке с сахарозой. Они получали слои с различными плотностями. Градиент плотности создавали при смешивании 50 и 30% растворов сахарозы. Смесь помещали в пробирку емкостью 100 и далее вводили 1 мл эмульсии М/В в 50% растворе сахарозы. В нижнюю часть пробирки вводили 5 мл 60% раствора сахарозы. Центрифугирование проводили при скорости до 2800 об1мин. [c.153]

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

При центрифугировании небольшого количества ДНК в концентрированном растворе хлористого цезия вскоре достигается равновесие. Действующие при этом противоположные процессы седиментации и диффузии приводят к установлению стабильного градиента концентраций хлористого цезия с непрерывным повышением плотности в центробеишом направлении. Макромолекулы ДНК сдвигаются под действием центробежной силы в зону, где плотность раствора равна собственной плотности ДНК. Этой тенденции противостоит процесс диффузии, в результате чего в условиях равновесия определенный вид ДНК оказывается сосредоточенным в узком слое. При наличии нескольких видов ДНК с различной плотностью каждый из них образует определенный слой в том месте, где плотность раствора хлористого цезия равна плотности данного вида ДНК. [c.65]

Из других тканей ядра иногда выделяют следующим образом хорошо размельченную ткань обрабатывают слабой кислотой, например лимонной, затем подвергают дифференциальному центрифугированию и осадок промывают очень разбавленной кис.по-той (фото 2). Напомним, что Мишер изолировал ядра из клеток гноя, пользуясь для этого разбавленной уксусной кислотой. Существует еще и метод с использованием лимонно кислоты, развитый и улучшенный Даунсом [142, 143], а также Мирским и Поллистером ]144], в чьих работах и можно найти его подробное описание. Изолировав при помощи лимонной кислоты ядра при различных значениях pH, Даунс [142] установил, что ядра, полученные при pH значительно ниже 3,0, несомненно, теряют большую часть содержащегося в них гистона. Поэтому при анализе всей такой ядерной массы данные о содержании нуклеиновых кислот и липидов бывают завышенными. Ядра же, изолированные при pH 6,0—6,2, оказываются лишенными некоторого количества нуклеиновой кислоты и, но-видимому, белков. В большинстве случаев для получения изолированных ядер, свободных от цитоплазматических остатков, применяют повторное промывание ядерной фракции разбавленным раствором хлористого натрия или лимонной кислоты. Не удивительно поэтому, что, как показали Мирский и его сотрудники [224], химическое определение белка всей массы изолированных таким путем ядер дает значительно более низкие величины, чем анализ ядер, выделенных в безводной среде. Впервые выделение ядер в безводной среде было осуществлено Беренсом [145]. Измельченную и лиофили-зированную ткань подвергали седиментации в колонках с градиентом плотности органических растворителей. В дальнейшем этот метод был модифицирован и улучшен [144—147]. Преимуще- [c.136]

Для определения молекулярного веса ДНК (обзоры — см. наиболее широко используются методы, основанные на определении скорости седиментации макромолекул. Это определение может быть выполнено по различным методикам наиболее широкое распространение в последнее время приобрела методика, основанная на зональном центрифугировании в градиенте плотности сахарозы в препаративной ультрацентрифуге В данном случае распределение веществ по скорости осаждения можно контролировать по радиоактивной метке, что обеспечивает высокую чувствительность с другой стороны, методика практически без изменений может быть применена и для препаративного разделения нуклеиновых кислот. Предложен ряд эмпирических уравнений, связывающих скорость седиментации двухцепочечного комплекса ДНК со значением молекулярного веса определенным независимыми методами. Последнее из этих уравнений охватывает пределы мол. веса 0,2— 130 108. [c.30]

А. Разделение путем аналитического ультрацентрифугирования (с использованием шлирен-оптики). Пик 1 соответствует 808-рибосомаи, пики г, 3, 4 а 5 соответствуют частицам, содержащим 2 рибосомы (коэффициент седиментации 1103), 3 рибосомы, 4 и 5 рибосом соответственно [1]. В. Отделение рибосом от полисом миксомицета путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Ник справа соответствует полисомам, в состав которых входит от 2 до 20 и более рибосом [26]. [c.26]

В седиментационном анализе можно проводить два типа экспериментов. При анализе методом скоростной седиментации проводят определения скорости оседания и диффузии частиц при бioльшиx скоростях вращения ротора, тогда как при анализе методом седиментационного равновесия выжидают установления равновесия между процессами седиментации и диффузии в процессе центрифугирования при меньших скоростях вращения ротора. Теоретически неоднородность распределения по молекулярным весам в образце можно охарактеризовать с помощью обоих указанных методов, получая методом скоростной седиментации распределение по коэффициентам седиментации, а методом седиментационного равновесия — распределение по молекулярным весам. Распределение по молекулярным весам легче интерпретировать хими-ку-полимерщику, не имеющему специальной подготовки. Было показано, что детализированный характер распределения по коэффициентам седиментации можно получить методом скоростной седиментации в отсутствие дополнительных предположений о форме кривой распределения. Такие дополнительные предположения, как правило, необходимы при анализе методом седиментационного равновесия. Скоростное ультрацентрифугирование приобрело, следовательно, наиболее широкое распространение при исследовании неоднородности распределения но молекулярным весам полученные этим методом данные обычно комбинируют с результатами других измерений, преобразуя кривую распределения по коэффициентам седиментации в кривую распределения по мол екулярным весам, в ряде случаев более подходящую для целей исследования. Метод седиментационного равновесия применяется в основном в качестве способа определения абсолютных величин средних молекулярных весов, но применение этого метода для растворов в смешанных растворителях ультрацентрифугирование в градиенте плотности), как недавно было показано, позволяет оценить распределение полимера по плотности. [c.216]

Центрифугирование в градиенте плотности, предложенное Ме-сельсоном [60], — ценный метод исследования природных и синтетических полимеров, основанный на различии в плотностях или скоростях седиментации его используют для разделения компонентов смеси полимеров на дискретные зоны (зонное центрифугирование). Например, сошлемся на развитие методики изучения равновесного центрифугирования в капиллярах [61 ]. [c.30]

Важным моментом в препаративном центрифугировании является выбор ротора. Для быстрого отбора тяжелых фракций удобны угловые роторы. В этом случае на стенке пробирки образуется тяжелый слой, стекающий конвекционным потоком ко дну. В результате осадок собирается на дне очень быстро, хотя из-за конвекций ухудшается разрешение близко седиментирующих фракций. Лучше всего седиментация протекает в ячейках с секториальной полостью, обеспечивающих почти полное отсутствие конвекции. Подробнее об ячейках с секториальной полостью см. в гл. IX. Седиментация в роторе с подвесными стаканами в этом смысле ближе к идеальной, но форма пробирок и здесь несекториальная. К тому же в таком роторе в начале и в конце вращения может происходить взмучивание осадка. Тем не менее такие роторы широко используются при работе с градиентами плотности. В роторах Андерсона рабочие полости имеют идеальную секториальную форму, их можно наполнять и освобождать прямо во время вращения. Такие роторы более других подходят для фракционирования больших объемов вещества в градиентах плотности в условиях, близких к идеальным. Для получения максимальных ускорений стали применять роторы, сделанные из титана. [c.35]

При описанном выше ультрацентрифугировании пики, наблюдаемые при помощи шлирен-системы, отвечают границам между раствором и растворителем. Первые, быстрые пики отвечают компонентам, движущимся в окружении более медленных компонентов (фиг. 8). В биохимических смесях некоторые из этих медленных компонентов (например, рибосомы при анализе бактериального экстракта) создают большую вязкость. Измеряемые коэффициенты седиментации могут при этом очень сильно отличаться от приведенного к стандартным условиям значения Поэтому полученные при помощи скоростной седиментации значения s не всегда можно непосредственно использовать при планировании и анализе данных препаративного зонального центрифугирования в градиентах плотности. При зональном ультрацентрифугировании анализируемая смесь наносится в виде слоя на раствор с увеличивающейся по направлению ко дну плотностью (что предотвращает конвекционное перемешивание) и различные компоненты седиментируют в градиенте плотности в виде отдельных зон. Для наслоения смеси можно использовать специальную аналитическую ячейку, в которой техника наслоения принципиально не отличается от обычного препаративного наслоения на градиент. Одна из таких ячеек (Be kman Instruments In .) приведена на фиг. 15. Преимущества применения такой ячейки, как отмечают Виноград и Брунер [11], состоят в том, что она требует меньше исследуемого материала, анализируемые компоненты в ней пространственно разобщены, медленные примеси отстают от быстрее движущихся зон и седиментацию последних можно осуществлять в любом растворителе, не прибегая к предварительному диализу. Растворитель должен быть более плотным по сравнению с [c.67]

Если макромолекулы центрифугировать в градиенте плотности, то их седиментация (или флотация) прекращается, когда величина (1 — ир) становится равной нулю. Яркий пример применения центрифугирования в градиенте плотности продемонстрирован в часто цитируемых работах Меселсона, Сталя и Винограда [25] и в последующих экспериментах Меселсона и Сталя. [c.126]

Точно так же, как для оценки времени осаждения в ультрацентрифуге компонента с данным ко фициентом седиментации s используются параметры ST, Pi или k, можно предложить аналогичный параметр к для зонального центрифугирования в градиенте плотности. В табл. 7 (данные фирмы Be kman Instruments In .) приведены значения этого параметра для различных роторов, выпускаемых этой фирмой. С помощью фактора к можно определить время, необходимое для седиментации частиц с данным коэффициентом седиментации и данной плотностью в градиенте плотности от мениска до дна пробирки. В таблице приведены девять значений этого фактора для различных роторов и для частиц с плотностями от 1,1 до 1,9 г/мл, седиментирующих в линейном градиенте сахарозы (5—20% по массе) при 5°С. [c.198]

Рассмотрим вкратце белковое и нуклеиновое хозяйство клетки Е. oli. Большая часть РНК (до 80%), а последней, как мы видели, в молодой клетке содержится 10г, находится в рибосомах. В ультрацентрифуге нри 10 g в течение 100—200 мин. можно провести полное фракционирование рибосом но константам седиментации. Полезным приемом является центрифугирование из небольшого объема суспензии рибосом, наливаемой тонким слоем на подслоенный раствор сахара. В растворе создается градиент концентрации сахара начиная с 20% у дна пробирки и до 5% непосредственно под образцом, что приводит к чрезвычайной [c.456]

Рис. 1. Седиментация препаратов суммарной РНК нормальных (Л) и облученных ( ) зародышей вьюна. РНК выделяли на стадии 8 час. развития после 2,5-часовой инкубации икры с С -карбонатом (15 мккюри/.чл смеси). Препарат РНК обрабатывали ДНК-азой. Центрифугирование проводили в градиенте сахарозы 5—20%, содержащей 0,1 М натрий-ацетатный буфер pH 5 и ЭДТА (0,01, М) в течение 12 час. при 10°С в роторе 5 У-25 ультрацентрифуги Спинко Ь

Макромолекулы почти нечувствительны к воздействию силы тяжести, однако в растворах, оставленных на длительное время в спокойном состоянии, постепенно возникает градиент концентрации. Сходное явление наблюдается в земной атмосфере, плотность которой, как известно, убывает с высотой. Седиментация под действием силы земного тяготения не нашла широкого применения при изучении макромолекул. Попытки использовать центрифугирование для очистки и идентификации белков оставались безуспешными вплоть до 1923 г., когда Сведберг и Ни-кольс сообщили о разработанной ими высокоскоростной центрифуге. Эта центрифуга содержала остроумно сконструироранное устройство, которое позволяло пропускать свет через кювету с образцом и регистрировать движение границы расположения макромолекул. Высокоскоростные центрифуги сведберговского типа получили название аналитических ультрацентрифуг в отличие от других высокоскоростных центрифуг, в которых отсутствует оптическая система. Устройство современной аналитической ультрацентрифуги схематически показано на рис. 7.14. Поскольку к изучаемому раствору нет прямого доступа, его концентрацию определяют оптическими методами. Если через кювету пропускается ультрафиолетовое излучение, то почернение фотографической пленки, установленной позади кюветы, будет тем меньше, чем выше концентрация макромолекуляр-ного соединения в растворе. При использовании рефрактометрических методов положение границы будет соответствовать пику, природу которого мы рассмотрели при объяснении рис. 7.13. Третий метод слежения за границей основан на использовании интерферометра, позволяющего определить положение и концентрацию растворенного вещества. Подсчитывая число интерференционных полос, можно определить концентрацию с точностью порядка 0,1%. [c.409]

При использовании метода, основанного на измерении скорости седиментации, градиент сахарозы может быть заранее приготовлен с помощью автоматического устройства, создающего градиент. Раствор, содержащий макромолекулярные частицы, осторожно наслаивают сверху. Хотя в результате такого наслаивания в верхней части раствора образуется область отрицательного градиента плотности, слой частиц поддерживается очень сильным положительным градиентом плотности сахарозы, которая препятствует осаждению каиелек жидкости и обеспечивает постоянную скорость миграции крупных молекул. В ходе центрифугирования под действием центробежных сил частицы мигрируют сквозь столбик жидкости и распределяются по дискретным зонам. Каждая зона содержит только молекулы одного типа, движущиеся вдоль градиента с характерной для них скоростью седиментации. По истечении заранее намеченного времени центрифугу останавливают, пробирки вынимают из ротора и тем или иным способом отбирают фракции. Поскольку в данном методе за расположением границ в процессе центрифугирования наблюдать невозможно, приходится действовать вслепую. В связи с этим для определения промежутка времени, оптимального для разделения на фракции, приходится проводить несколько пробных центрифугирований. [c.417]

Центрифугирование в градиенте плотности основано на том же принципе. Как и в вышеуказанном случае, градиент плотности создается градиентом концентрации. В колонке градиент концентрации достигается тем, что слои с различной концентрацией помещают друг над другом, после чего начинается медленная диффузия, постепенно выравнивающая градиент. Роль сил тяготения сводится главным образом к стабилизации системы путем снижения до минимума конвекционных токов. Наоборот, при центрифугировании в градиенте плотности градиент концентрации является результатом сил, действующих в центрифуге, и достигает равновесного значения. Установленный таким образом градиент плотности достаточно стабилен. Этот эффект был использован Пикельсом [2] для снижения конвекции в опытах по центрифугированию. Такой же принцип применяли Калер и Ллойд [31 в своих опытах с так называемой стабилизированной движущейся границей в препаративной ультрацентрифуге. Другим применением градиента плотности является зонное центрифугирование —методика, разработанная Брекке [4], которая позволяет разделять компоненты смеси полимеров на дискретные зоны. Предварительно создают градиент плотности, так что ни в одной точке плотность не превышает плотности любого из компонентов исследуемого образца, раствор которого помещают сверху, а затем подвергают центрифугированию. Различные компоненты мигрируют в разные зоны, которые все более и более разделяются по мере центрифугирования. Еще до того, как движущаяся с наибольшей скоростьЕо зона достигнет дна кюветы, центрифугу останавливают и анализируют различные зоны. Очевидно, что метод основан на различиях в скоростях седиментации. Градиенту плотности принадлежит второстепенная ролы стабилизация системы и влияние плотности жидкости на скорость седиментации. [c.418]

Вопрос о возможном композиционном распределении в природных полимерах представляет чрезвычайный интерес. Для его решения Суеока предложил [59] комбинировать результаты центрифугирования в градиенте плотности с исследованием скоростей седиментации. Болдвин и Шутер [60] разработали оригинальный метод центрифугирования в градиенте плотности с предварительно образованным градиентом. Метод будет рассмотрен ниже. И наконец, будет показано, как из результатов центрифугирования в градиенте плотности может быть получена информация о флуктуациях молекулярного веса и кажущегося парциального удельного объема. [c.438]

Наномним, что нри центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не ни различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, п при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэ/ому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифуг гированием в градиенте солей цезия, которое широко иснользуется для разделения молекул по их плавучей плотпостп. [c.127]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология