Адсорбция ферментов концентрация фермента

С помощью избирательной адсорбции можно сконцентрировать ферментный раствор, если первоначальный объем его был большим, а концентрация фермента в нем невысока — элюция обычно осуществляется небольшим объемом. [c.204]

Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитов сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100%, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя. [c.88]

Рис. 88. Зависимость адсорбции фермента тирозиназа на окисленной (/) и восстановленной сажах (2) от концентрации белка в растворе

Избирательную адсорбцию ферментов проводят двумя основными способами. Если фермент адсорбируется, то его тем самым извлекают из смеси, а затем элюируют. При этом балластные белки в растворе остаются в подобных случаях говорят о положительной адсорбции. Возможно и обратное — фермент не адсорбируется, а действие адсорбента состоит в том, что он убирает из раствора неактивные, загрязняющие фермент белки, которые способны связываться с ним. Тем самым ферментный белок очищается. Это случай негативной (отрицательной) адсорбции. При любом варианте необходимо тщательно соблюдать условия pH, температуры и ионной силы. Если в растворах ферментов содержатся — часто это бывает после солевого фракционирования — значительные количества минеральных солей, то они мещают адсорбции и их лучше удалить либо диализом, либо пропустив раствор через сефадекс. Кроме того, для лучшего связывания фермента желательно, чтобы концентрация его в растворе была невелика (не более 0,5—1,0%), количество адсорбента было большим, по весу в 15—20 раз превышающим количество ферментного белка, а pH среды был слабокислым. [c.149]

В случае, когда локальные концентрации ферментов, клеток и самого ксенобиотика вблизи поверхности увеличиваются, или на поверхности протекают абиотические реакции трансформации, сопряженные с биологическим процессом, адсорбция стимулирует деградацию. [c.351]

Протекание процесса адсорбции и прочность связывания фермента с носителем в значительной степени зависят от условий проведения иммобилизации. Основными факторами, влияющими на адсорбцию фермента, являются удельная поверхность и пористость носителя, значения pH и ионной силы раствора фермента, его концентрация и температура проведения процесса адсорбции. [c.49]

Большинство исследователей под аффинной хроматографией понимают использование иммобилизованного на адсорбенте лиганда, осуществляющего специфический отбор связывающихся с этим лигандом белков (разд. 4.5). После адсорбции фермент может быть элюирован либо неспецифическим образом, например, путем повышения концентрации соли, либо специфическим в результате замещения белка свободным лигандом в растворе. Следовательно, аффинная хроматография может включать две специфические стадии — аффинную адсорбцию и аффинную элюцию . Механизм элюции со специфического адсорбента достаточно ясен. С практической точки зрения присутствие лиганда снижает коэффициент распределения с 1,0 до значитель- [c.133]

Интересно, что при выводе уравнения Ленгмюра не использовано предположение о том, что адсорбция протекает на геометрически единой поверхности. Адсорбент рассматривается только как совокупность одинаковых центров связывания. Поэтому все сказанное в равной мере относится и к связыванию молекул субстрата на глобулах фермента или к любому другому бимолекулярному взаимодействию в гомогенных системах, при котором на опыте можно определить свободную концентрацию г-го компонента при равновесии. [c.165]

Для адсорбции белков достаточно перемешать раствор после добавления геля до получения однородной суспензии. После центрифугирования осадок отбрасывают, если ставилась задача адсорбировать балластные белки. Если адсорбирован фермент, осадок геля промывают несколько раз водой или слабым буферным раствором (если это не сопровождается потерей фермента). Для элюции фермента используют слабощелочной буферный раствор более высокой концентрации, чем тот, что использовался при промывании геля. Если фермент элюируется плохо, в буфер для увеличения элюции добавляют соль, [c.204]

Известна точка зрения, согласно которой эффективность адсорбции эндоглюканаз коррелирует со скоростью гидролиза кристаллической (но не аморфной) целлюлозы [140]. Если концентрация прочно и слабо адсорбирующихся эндоглюканаз на поверхности целлюлозного субстрата равна, скорость его гидролиза в случае прочно адсорбирующихся ферментов будет больше, тогда как для аморфного субстрата = тот эффект не проявляется. Обнаруженная корреляция [140] справедлива для эндоглюканаз ряда целлюлазных комплексов, однако пока не ясно, является ли она общей или носит частный характер. [c.82]

Модель гидролиза целлюлозы в колонном реакторе позволила адекватно описать распределение ферментов по длине реактора при их адсорбции на поверхности субстрата и предсказать зависимости концентрации продуктов на выходе из реактора от времени при различных степенях заполнения субстрата адсорбированными ферментами и различных скоростях потока. Кроме того модель позволяет рассчитать такие важные параметры, как производительность реактора и степень конверсии субстрата за различное время гидролиза. На рис. 6.3 и 6.4 приведены примеры расчетов параметров процесса ферментативного гидролиза целлюлозы в проточном колонном реакторе. [c.177]

Адсорбционная теория. Согласно теории гетерогенного катализа (катализ на поверхности), скорость химической реакции увеличивается, если молекулы реагирующих веществ адсорбированы на измельченных частиц 1Х катализатора, в результате чего повышается концентрация этих молекул. Благодаря адсорбции создаются условия для лучшего взаимодействия молекул друг с другом на поверхности катализатора. Возможно также, что при гетерогенном катализе большое значение имеет силовое поле катализатора, под влиянием которого электронная структура адсорбированных молекул нарушается, что способствует более легкому химическому взаимодействию их с молекулами другого соединения. Так как ферменты находятся в клеточном соке в виде мельчайших коллоидных частиц, т. е. образуют с водой гетерогенные системы, то указанные выше представления о механизме гетерогенного катализа могут быть применены и к ферментативным процессам. [c.522]

Адсорбция растворенного вещества из подвижной фазы стационарной фазой,—-как правило, экзотермический процесс согласно принципу Ле Шателье, повышение температуры должно приводить к сдвигу равновесия в направлении поглощения тепла. В условиях хроматографии повышение температуры сдвигает равновесие к более высоким относительным концентрациям в подвижной фазе, и высокие температуры приводят к более быстрой миграции через хроматографическую колонку. Вообще для ферментов с более экзотермической адсорбцией наблюдается большая зависимость последней от температуры [9]. [c.86]

Опарин показал, что при достижении критической концентрации. белков и нуклеиновых кислот в воде они выделяются из раствора в виде крошечных капелек (называемых коацерватами). Концентрация белков и нуклеиновых кислот в этих капельных гораздо выше, чем в исходном растворе, и капельки коацервата имеют гораздо более высокую степень организации. Кроме того, при добавлении фермента происходит его избирательная адсорбция на капельках коацервата, где фермент становится более активным, чем в растворе. Это очень интересно, поскольку то же самое наблюдается в живых клетках, однако в данном случае это происходит в гораздо более простой системе. [c.28]

После проведения адсорбции адсорбент собирают и фермент элюируют по возможности минимальным количеством буфера. Если при адсорбции равновесие обычно наступает быстро, то элюирование — гораздо более медленный процесс. Оно осуществляется чаще всего растворами, которые содержат относительно высокие концентрации поливалентных анионов и имеют щелочные значения pH (фосфатные, боратные буфера). Адсорбент, связавший фермент, обрабатывают несколько раз небольшими порциями элюента и каждый раз центрифугируют или фильтруют. Перед элюированием адсорбат лучше промыть водой илй [c.149]

Рис. 3.9. Адсорбция ферментов препарата целлюлазного комплекса Т.кочтди (концентрация по белку 1 г/л) на порошковой целлюлозе Solka Floe (4 г целлюлозы в рабочей камере экспериментальной установки) при 25° С, pH 4,5, в 0,1 мМ ацетатном буфере и скорости потока 0,7 мл/мин. Сплошная кривая отражает уровень белка на выходе из рабочей зоны, пунктирная кривая — концентрацию ВС — концентрация белка на входе в рабочую камеру установки в начале эксперимента, о — концентрация ВС. Напряженность поля составляла

В отсутствие электрического поля при пропускании раствора целлюлазного ферментного препарата через слой порошковой целлюлозы в рабочей камере установки на целлюлозе адсорбируется некоторое количество ферментов, определяемое их природными адсорбционными характеристиками. Через некоторое время адсорбция прекращается и концентрация ферментов на выходе из рабочей камеры приближается к концентрации на ее входе (рис. 3.9). При включении тока концентрация ферментов на выходе из рабочей камеры резко падает. При увеличении напряженности поля эффективность электроудерживания возрастает вплоть до предельного значения, когда все входящие в рабочую камеру ферменты удерживаются на цел цолозе и их концентрация на выходе из камеры равняется нулю (рис. 3.9). Максимальная эффективность электроудерживания наблюдается при достижении напряженности поля определенной пороговой величины, которая мало зависела от природы ферментного препарата, но была пропорциональна его концентрации в растворе на входе в рабочую камеру. Например, при концентрации раствора (по белку) 1 г/л пороговое значение напряженности поля составляет около 100 В/см. Без отключения тока десорбция ферментов не наблюдается, тогда как [c.88]

Общую картину происходящих при э л ектр о удерживании процессов можно описать следующим образом. В присутствии электрического поля возникает диполофоретический транспорт молекул ферментов к поверхности целлюлозы. Поскольку целлюлоза не проводит ток, то происходит концентрирование молекул ферментов в зазорах между частицами целлюлозы в этих областях локальные концентрации фер]) ентов могут значительно превышать их концентрацию в исходном растворе, поступающем на целлюлозный электрофильтр. Именно локальное увеличение концентрации ферментов в растворе [Е]о вблизи частиц целлюлозы приводит к смещению равновесия в уравнении адсорбции влево, поскольку Кр в присутствии поля не изменяется [c.90]

При моделировании гидролиза целлюлозы в колонном реакторе последний представляли в виде каскада последовательно соединенных проточных реакторов (ячеек). Поскольку на стадии адсорбции ферменты распределялись по элементарным ячейкам неравномерно, т.е. образовывался градиент концентрации ферментов по длине реактора, процесс моделирования включал расчет двух стадий адсорбция и распределение целлюлаз вдоль реактора (1) и собственно гидролиз (2). [c.176]

Белковый характер ферментов. Выше уже отмечалось, каким путем были получены водные экстракты, соки или даже твердые аморфные осадки, содержащие различные ферменты. До выделения чистых ферментов невозможно было оценить концентрацию фермента в этих сырых ферментативных препаратах. Однако на этом этапе исследований удалось получить в результате различных операций очистки препараты, в тысячу раз более активные, чем исходные тем самым было доказано, что ферменты являются, как правило, крайне активными катализаторами, действующими дан е в очень малых концентрациях. Этот результат не давал, естественно, никаких указаний в отношении абсолютной концентрации фермента. Среди методов очистки и концентрирования, примененных прежними исследователями, следует особо отметить метод, которым пользовались Вильштеттер и его ученики, очень сходный с современньш хроматографическим методом, а именно адсорбцию на таких твердых материалах, как каолин или окись алюминия, и последующее элюирование солевыми растворами. Эти исследования показали, что ферменты имеют коллоидный (на современном языке макромолекулярный) характер, но они не позволили уточнить их химический характер. [c.792]

Л/ фосфатным буфером при pH, 5. Адсорбцию ферментов ка карбоксиметилцеллюлозе проводили из 0,005]1 фосфатного буфера (pH 5), а элюцию при ступенчатом увеличении концентрации КаС1. Ферменты, полученные после хроматографии на целлюлозных ионообменниках, подвергали дальнейшей очистке Ef изучали [c.158]

В качестве аффинных лигандов можно использовать любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Химическое строение аффинных лигандов может быть самым различным. Поскольку в настоящее время метод аффинной хроматографии применяется главным образом для выделения ферментов и их ингибиторов [89J, мы рассмотрим примеры, взятые из этой области. Как уже упоминалось, при выделении фермента аффинными лигандам1И могут служить его ингибитор, аналогичный субстрату, а также эффектор, кофактор и в отдельных случаях даже субстрат. Это справедливо и для фермента, требующего длл реакции два субстрата, но способного достаточно сильно связываться только с одним из них. Субстрат также можно использовать для адсорбции фермента в таких условиях, когда фермент связывается, но сам не способен катализировать реакцию (например, в отсутствие ионов металлов, необходимых для реакции), а также когда константа Михаэлиса зависит от pH или температуры. Аффинный адсорбент для выделения белков обычно трудно получить из аффинного лиганда, если константа диссоциации его комплекса с белком превышает (0,5—1,0)-Ю [16]. Однако Стире и сотр. [84] показали, что очень эффективный адсорбент для р-галактозидазы можно получить даже из такого относительно слабого ингибитора, как н-аминофенил-р-о-тиогалактопирано-зид (/i , 5-10 ). Этого удается достигнуть, повышая концентрацию нерастворимого аффинного лиганда и увеличивая расстояние между аффинным лигандом и матрицей носителя, что приводит к максимальной доступности аффинного лиганда, для белка в растворе. [c.9]

Значения констант можно сравнивать только в том случае, если они устанавливались в точно соблюдаемых условиях, т. е. при определенной температуре, pH, продолжительности инкубации и реакции, концентрации фермента и субстрата. Так, например, в электрометрическом методе фермент инкубируют 30 мин при 25 °С, исходное значение pH 8,0 реакцию с ацетилхолином проводят в течение пОмин при концентрации последнего 7,3-10" лголь/л. Для определения значения I50 измеряют активность ингибитора при различных его концентрациях. По полученным результатам строят график, в котором процент угнетения (отношение ингибированного фермента к неингибированно-му) сопоставляют с отрицательным логарифмом концентрации ингибитора. Пример такой обработки опытных данных представлен на рис. 7. Истинное значение piso искажается побочными реакциями, протекающими в зависимо- сти от свойств ингибитора и фермента, а также условий опыта. Такими побочными реакциями, конкурирующими с ингибированием фермента, являются спонтанный гидролиз субстрата, гидролиз ингибитора, вызываемый содержащимися в ферменте фосфорилфосфа-тазами, адсорбция на стенках стеклянного сосуда при работе с очень разбавленными растворами, реакция с другими активными группами присутствующих белков. Кроме того, в случае слабого ингибитора одновременно протекают и угнетение, и реактивация фермента. Некоторые авторы считают, что для бимолекулярной реакции между ингибитором и ферментом [c.164]

Влияние химических факторов на активность ферментов. Активность ферментов значительно меняется в зависимости от изменения условий, в которых они действуют. Так, например, для каждого фермента существует определенная область концентрации водородных ионов, в которой лежит оптимум его действия. Для пепсина оптимальное значение рН=1,5—1,6 для трипсина 7,8—8,7 для сахаразы 4,5 для липазы рицинуса 4,7 для липазы поджелудочной железы 8,0 и т. д. Однако на положение оптимума влияет степень очистки фермента. Так, например, оптимальное pH для липазы из слизистой оболочки желудка собаки равняется 5,5—6,3 после электродиализа оно будет 6,3—7,1 после адсорбции каолином 7,1—7,9. В области оптимального pH ферменты обычно устойчивы, но это небезусловно для трипсина оптимум расщепления белка лежит при рН=7,8—8,7, а наибольшая устойчивость—при рН=6,0 для пепсина оптимум действия при рН=1,5—1,6, а наибольшая устойчивость наблюдается при рН==4,0. [c.338]

Помимо чисто химического, гомогенный катализ имеет громадное биологическое значение. В организмах и животных, и растений содержатся ферменты — органические вещества сложного строения, играющие роль катализаторов при разнообразных жизненных процесса х. Они обнаруживают резкую специфичность действия, так как каждый из них ускоряет только определенный процесс, не влияя на другие. В этом отношении ферменты превосходят неорганические катализаторы которые большей частью могут ускорять ряд сходных по химизму реакций. В химизме гетерогенного катализа важнейшую роль nrpaetr адсорбция. Благодаря ей на поверхности катализатора создается увеличение концентрации реагирующих частиц, что уже са о по себе ведет к ускорению реакции. Однако несравненно более важным фактором является повышение химической активности адсорбированных молекул по сравнению с их обычным состоянием. Это (как и сама адсорбция) обусловлено действием силового поля катализатора и сказывается в резком возрастании доли успешных столкновений между взаимодействующими частицами. В результате соЬтвет-ственно увеличивается скорость реакции. [c.343]

Другим важным файтором, определяющим формирование метаболона, являются уровни концентраций определенных метаболитов. Известно, что адсорбция ферментов на биологических мембранах чувствительна к присутствию специфических метаболитов. Сведения о влиянии метаболитов на связывание гликолитических ферментов с мембраной эритроцитов и со структурными белками скелетных мышц приведены в работе [50]. Адсорбция цитратсинтазы на внутренней мембране митохондрий усиливается в присутствии низких концентраций цитрата и ослабляется в присутствии оксалоацетата, СоА, аце-гил-СоА, АТРМд, а также высоких концентраций цитрата [54]. [c.189]

Иониая сила. Значение этой величины оказывает влияние на прочность связывания фермента с носителем. При высокой концентрации солей присутствующие в растворе ионы вытесняют с поверхности носителя связанные за счет электростатических взаимодействий белковые молекулы. Иными словами, возрастание ионной силы вызывает десорбцию фермента. Однако иногда эта закономерность не действует, и увеличение концентрации соли, наоборот, способствует адсорбции фермента на носителе. В таких случаях принято говорить об эффекте высаливания белка из раствора. ч- [c.50]

Коицеитрация фермента. При возрастании концентрации фермента в растворе, из которого происходит адсорбция, количество сорбировавшегося на носителе фермента увеличивается и соответственно растет удельная каталитическая активность иммобилизованного препарата. Зависимость удельной каталитической активности от исходной концентрации фермента, как правило, имеет вид кривой с насыщением, что свидетельствует [c.50]

М раствор Na l в 1 М llEPES-буфере (р11 7,5) из расчета 50 мкл на 1 мл элюата. Высокая концентрация соли обеспечивала растворимость фермента и препятствовала неспецифической адсорбции. [c.413]

Создан противоточный реактор непрерывного действия для ферментативного гидролиза [1] В этом реакторе реализован ряд новых принципов Во-первых, рабочая зона колонного реактора плотно наполняется целлюлозой, чем достигается ее более высокая концентрация (до 40%) и более высокая объемная скорость гидролиза, чем в реакторах другого типа, например с перемешиванием Во-вторых, целлюлазы удерживаются на целлюлозе в реакторе за счет адсорбции по принципу аффинной хроматографии Это позволяет обойтись без специальных мембран, удерживающих ферменты в реакторе, что удешевляет процесс В-третьих, в таком реакторе можно использовать культуральные жидкости с достаточно низким содержанием целлюлазы, так как эти ферменты концентрируются в реакторе за счет адсорбции В-четвертых, протеазы и другие ферменты, инактивирующие целлюлазы, удаляются из реактора еще до начала гидролиза целлюлозы, поскольку они, как правило, адсорбируются на целлюлозе [c.211]

Это уравнение удобнее рассматривать в неинтегрированном виде. Обозначив —dSIdt через v, найдем, что кривая зависимости v от So имеет вид. представленный на рис. 42. Эта зависимость имеет тот же вид, как и общеизвестные в химии ферментов уравнение Михаэлиса— Ментона и в адсорбции уравнение Лэнг-мюра, и тесно связана с уравнением, описывающим перенос цепи при винильной полимеризации. Легко показать, что постоянная защиты k, /k.2, выражающая отношение скорости реакции радикалов с веществом Р к скорости реакции радикалов с субстратом S, равна значению So, при котором v равно половине максималь-НОЙ скорости При высоких концентрациях субстрата рассматриваемая скорость инактивации достигает Рмакс. так как действие вещества Р постепенно падает при возрастании So. [c.235]

Связывание лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-б -АМР — сефарозе настолько сильно, что фермент нельзя элюировать даже 1 М КС1 при 40 °С. Однако для элюирования можно использовать линейный градиент концентрации NADH. На рис. 5.12 показан график зависимости концентрации NADH, необходимой для элюирования лактатдегидрогеназы, от температуры. С повышением температуры необходимая концентрация специфического элюирующего агента уменьшается, что отражается линейным графиком Аррениуса. Соответствующая энергия адсорбции составляет 54,6 кДж/моль (13,0 ккал/моль) [9]. [c.87]

A. Проводились исчерпывающий диализ 0,5 мл экстракта фермента, силсржащеги 40,5 Е фосфофруктокиназы и 10 Е или 9,9 мг/мл алкогольдегидрогеназы, против 10 мМ фосфата (pH 6,5). содержащего 0,2 моль/л КС (этот буфер был также использован для уравновешивания), и адсорбция на колонке с АМР — сефарозой. Затем матрица последовательно промывалась а) уравновешивающим буфером (24 мл) б) 5 мМ NADH в том же буфере (5 мл) в) буфером (5 мл) г) 5 мМ. МР-ЬБ м.М.. Mg2-I- в буфере (5 мл). Скорость потока 0,4 мл/мин, . Элюирование в градиенте концентрации K I в условиях, описанных выше (А). После адсорбции колонка промывалась 20 мл 10 мМ фосфатом (pH 6,8), содержащим 0,2 моль/л КС . Линейный градиент концентрации (0,2—0,8 моль/л) КС создавали в том же буфере объем [c.112]

Пенициллин-селективный электрод можно использовать для определения концентрации пенициллина в диапазоне 10 -5-10 моль/л. pH пробы оказывает решающее влияние на работу электрода, так как концентрация ионов водорода влияет на растворимость и стабильность пенициллина, а также на активность фермента. При pH < 5 пенициллин малорастворим, а при pH > 8 нестабилен. Хоу и Пул [586] нашли, что оптимальная активность пенициллиназы наблюдается в диапазоне pH 5,8—6,8 для всех видов пенициллина, представленных в табл. 16.1. Наибольшая чувствительность и скорость установления потенциала электрода имеет место при pH 6 — 7, и, как обычно, для проведения анализа можно рекомендовать среднее значение pH 6,4. Электрод работает по крайней мере в течение двух недель, время отклика составляет от 15 до 30 с. По самой своей природе электрод чувствителен не только к ионам водорода, но и ко многим однозарядным катионам. Для того чтобы исключить влияние посторонних ионов, Куллен и др. [585] сконструировали новый пенициллин-селективный ферментный электрод, который изготовлен таким образом, что иммобилизация фермента происходит в результате адсорбции пенициллиназы на пористом стеклянном диске, который фиксируется на плоской поверхности стеклянного рН-электрода. Такой электрод чувствителен только к пенициллину и не меняет свой потенциал в присутствии однозарядных катионов. Кроме того, электрод проще [c.198]

В гомогенной реакции присоединение протона к одному или нескольким атомам кислорода в молекуле паральдегида, по-видимому, ослабляет связь С —О. Поскольку, однако, в случае гетерогенной реакции было показано, что сульфаты ведут себя аналогично ферменту, можно также предположить ослабление связи С —О, которое вызвано не только адсорбцией кислородных атомов паральдегида на активных центрах (бренстедовских и льюисовских кислотных центрах), но и взаимодействием между центрами иной природы и остальной частью молекулы субстрата. В табл. 31 приведены константы скорости реакции первого порядка к, найденные для деполимеризации паральдегида в бензоле при 30°С на некоторых твердых кислотных катализаторах, а также в присутствии трихлоруксусной кислоты. Здесь же даны величины кислотности при //д< + 3,3 [34]. Как следует из таблицы, активность, отнесенная к единице концентрации кислотных центров, для гетерогенных катализаторов выше, чем для трихлоруксусной кислоты. Если взять за основу сравнения эту величину (для < -3), то исследованные катализаторы дадут следующий ряц N 80, СиЗО, А120з 8Ю = 1100 320 1, характеризующий относительную активность образцов. [c.128]

Экстракция растворимых белков из тканей может происходить только после разрушения клеточных оболочек, так как последние непроницаемы для больших белковых молекул. Разрушения клеток можно достичь механическим путем, растирая их с песком или с кизельгуром однако при этом наблюдается некоторая потеря белка за счет денатурации, вызываемой адсорбцией белка на силикате. По этой причине лучше разрушать клетки такими приборами, как мясорубка Латапи или гомогенизаторы. Структура клетки разрушается также при действии органических растворителей, например спирта, ацетона или глицерина. Если концентрация глицерина не превышает 85%, то в глицериновый экстракт переходит значительная часть растворимого белка. Этим способом можно экстрагировать гидролитические ферменты из поджелудочной железы и из других органов. Глицериновые экстракты при комнатной температуре относительно стабильны. Повидимому, рыхлая ассоциация белка с полярными гидроксильными группами глицерина уменьшает скорость его денатурации. Однако эти же полярные группы в молекуле глицерина обусловливают взаимное притяжение его молекул и высокую вязкость этого растворителя. Из глицериновых экстрактов очень трудно поэтому получить чистые препараты белков. В связи с этим глицерин в настоящее время редко применяется для разрушения клеточных оболочек. Вильштеттер и его сотрудники для разрушения клеток пользовались ацетоном. Этот метод основан на том, что многие белки при концентрации ацетона выше 80—90% денатурируются очень медленно. Для экстракции размельченный или пропущенный через мясорубку орган помещают в ацетон. Преимущество этой процедуры заключается в том, что ацетон не только разрушает клеточные оболочки, но одновременно экстрагирует из клеток и большинство липидов. Липиды можно затем удалить количественно при последующей обработке эфиром. Остаток после удаления липидов высушивается на листе фильтровальной бумаги и экстрагируется водой, разведенными растворами солей или буферов. Хотя большинство белков, в том числе много важных ферментов, можно получить из ацетоновых вытяжек в нативном состоянии, однако надо помнить, что некоторые лабильные белки при действии этого растворителя денатурируются. [c.10]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология