Взаимодействие фермента с субстратами температуры

Одним из характерных проявлений жизни является удивительная способность живых организмов кинетически регулировать химические реакции, подавляя стремление к достижению термодинамического равновесия. Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, pH среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента. [c.134]

Под ферментативной кинетикой понимают закономерности изменения скорости реакции в зависимости от химической природы реагирующих веществ и условий их взаимодействия. Под условиями взаимодействия понимают влияние концентрации реагирующих веществ, температуры, давления, присутствия ингибиторов или активаторов и т. п. В настоящем разделе из всех перечисленных факторов рассматривается только влияние концентрации субстрата и фермента. [c.374]

В последние годы исследованию окружения аминокислотных остатков в белках и их доступности для реагентов уделяется особенно много внимания, что объясняется многими причинами. Во-первых, познание реакционной способности каждого аминокислотного остатка в связи с непосредственным окружением приведет к пониманию различных химических свойств белков и ферментов. Например, механизм действия ферментов можно описать с точки зрения сродства и повышенной реакционной способности аминокислотных остатков активного центра по отношению к субстрату. Во-вторых, доступность аминокислотных остатков действию реагентов зависит от конформационных изменений белков, вызываемых сменой pH, температуры, ионной силы, взаимодействием с субстратом и т. д. Изучая доступность для реагентов отдельных остатков в различных условиях, можно делать выводы о структуре нативных белков. В-третьих, молярные доли остатков в различных состояниях обычно определяют путем измерения кругового дихроизма (дисперсии оптического вращения), параметров ионизации, спектральных смещений при образовании водородных связей или других изменений в окру- [c.344]

У молекул ферментных, как и всех иных, белков конфигурация макроструктуры не является абсолютно жесткой. И пространственная, и электронная конфигурации подвержены динамическим изменениям, которые называют флуктуациями. Они придают макроструктуре белков гибкость и, в целом, значительно повышают ее общую реакционную способность. Известны, например, флуктуации распределения электрических зарядов в молекуле белка, которые происходят под влиянием диэлектрических свойств растворителя, взаимодействий с внешними диполями или, чаще всего, спонтанно. Известно, что спирализованные и неупорядоченные участки макроструктуры могут обратимо переходить друг в друга под влиянием сдвигов pH, температуры. Все это определяет возможность изменений, гибкость третичной структуры, которые выявляются при взаимодействии фермента с субстратом. [c.80]

Для того чтобы протекал ферментативный процесс, необходимо постоянное поступление в активный центр фермента субстратов и удаление продуктов. В растворе скорости этих процессов определяются простыми законами диффузии их можно ускорить или замедлить, изменяя температуру или вязкость растворителя. В клетке ферменты и субстраты могут быть разделены мембраной, и тогда любой фактор, оказывающий влияние на проницаемость мембран, может служить регулятором ферментативного процесса. Так, например, повышение проницаемости мембран митохондрий для жирных кислот под действием карнитина приводит к значительному ускорению процессов р-окисления, В ряде случаев такие регуляторы могут непосредственно связываться с субстратами или ферментом и тем самым изменять их компартментализацию, а в ряде случаев регулятор может взаимодействовать с другими структурами клетки и, изменяя проницаемость для субстратов или продуктов, вызывать дистанционную регуляцию ферментативных процессов. К числу последних могут относиться как внутриклеточные метаболиты (например, жирные кислоты, изменяя проницаемость мембран митохондрий для Н+ и Са +, могут влиять на сопряжение дыхания с фосфорилированием), так и специфические регуляторы, например, гормоны и медиаторы. [c.35]

В неживой природе активация молекул осуществляется путем нагревания (увеличение температуры на 10 °С увеличивает скорость реакции в 2—3 раза), повышения давления, облучения либо введением катализатора. В живом организме превращение веществ осуществляется благодаря снижению энергетического барьера реакции ферментами-катализаторами. Ферменты взаимодействуют с субстратом и снижают энергию активации, необходимую для начала реакции (рис. 35). [c.96]

Под ферментативной кинетикой в широком смысле понимают зависимость скорости реакции, ускоряемой ферментом, от химической природы реагирующих- веществ (субстраты, фермент) и условий их взаимодействия (концентрация, температура, pH среды, наличие активаторов или ингибиторов и т. п.). Однако зависимость скорости ферментативного процесса от температуры, pH среды и влияния ингибиторов и активаторов в значительной мере связана с изменением свойств фермента как белкового тела. Поэтому здесь будет освещен только вопрос о закономерностях, определяемых природой и концентрацией реагирующих веществ и их изменением. [c.105]

Механизмы метаболических процессов очень напоминают механизмы реакций, проводимых в лабораторных условиях, с тем отличием, что если в лаборатории часто работают прн повышенных температурах и давлении, с безводными (часто ядовитыми) растворителями, с сильными кислотами и основаниями и с нетипичными для природы реагентами, то метаболические процессы протекают при весьма умеренных условиях в разбавленных водных растворах в интервале температур от 20 до 40 °С при pH от 6 до 8 и с участием чрезвычайно эффективных катализаторов — ферментов. Можно сказать, что каждая ступень метаболического процесса катализируется специфическим ферментом. Ферменты представляют собой вещества белковой природы их каталитическое действие оказывает влияние не на положение равновесия реакции, а на ее скорость, которая очень сильно увеличивается — часто на несколько порядков по сравнению со скоростью реакции, проводимой в лабораторных условиях. В состав некоторых ферментов входят коферменты, имеющие небелковый характер. Подвергающийся превращению субстрат сначала связывается с активным центром фермента, поблизости от которого расположен кофер-мент. При этом реагирующая группа субстрата и кофермент так сориентированы в пространстве, что реакция между ними протекает практически мгновенно. Затем прореагировавший субстрат отделяется от активного центра фермента, а измененный кофермент регенерируется под действием другого субстрата. Если в ферменте нет кофермента, то два субстрата непосредственно взаимодействуют в активном центре. [c.180]

В обычных условиях ферментативной реакции фермент-субстратный комплекс — образование эфемерное, так как сразу же после его возникновения происходит основная реакция. Однако, если реакция по тем или иным причинам заторможена (например, при низкой температуре), то фермент-субстратный комплекс становится способным к длительному существованию. Такая ситуация возникает, в частности, для ферментативной реакции типа А + В -> С + В при недостатке одного из субстратов. Например, фермент и субстрат А образуют нормальный комплекс, но в отсутствие субстрата В он не способен к дальнейшему превращению и потому стабилен. Именно такой механизм образования стабильного фермент-субстратного комплекса, согласно излагаемой гипотезе, лежит в основе специфического, взаимного распознавания и сцепления клеток в ряде случаев межклеточных взаимодействий. [c.160]

Факторы, регулирующие активность ферментов, разнообразны по своей природе (рис. 28). Физические факторы (температура, давление, свет, магнитное поле, электрические импульсы) оказывают менее специфическое действие, чем химические. В свою очередь действие последних также может быть разделено на несколько типов. Одни химические вещества связываются с активным центром фермента, например субстраты, кофакторы, конкурентные ингибиторы, что приводит к изменению ферментативной активности. Другие вещества взаимодействуют со специальными участками на поверхности молекулы определенного типа фермента, не имеющими непосредственного отношения к центрам каталитической активности, но тем не менее приводящими к ее изменению. [c.113]

При исследовании обратимых ингибиторов определение зависимости константы ингибитора (константы диссоциации комплекса фермент — ингибитор Кд от температуры позволяет рассчитать А/ , АЯ и А5 для взаимодействия ингибитора с ферментом. При этом используются те же уравнения термодинамики, которые применяются для анализа реакции с субстратом. Таким образом, для реакции образования комплекса Е1 [c.135]

Легко видеть, что влияние температуры на взаимодействия между ферментами и их субстратами и модуляторами сулит организмам как добро , так и зло . Если усиление взаимодействия, определяемого слабой связью (или евязями), облегчает протекание какого-то процесса, то изменение температуры, стабилизирующее эту связь (или связи), может давать организму преимущество. Если, например, более высокая способность фермента к присоединению молекулы субстрата благоприятна для его активности (что, как мы знаем, имеет место при низких концентрациях субстрата) и если слабые связи, стабилизирующие фермент-субстратный комплекс, при низкой температуре усиливаются, то возможно частичное снятие замедляющего влияния низкой температуры на данную реакцию. Если же, наоборот, слишком высокая или слишком низкая температура делает основанное на слабых связях взаимодействие между ферментом и субстратом (или модулятором) очень нестабильным, то это может сказываться на реакции и на организме отрицательно, [c.222]

Молекулярная основа отрицательной температурной модуляции ферментов остается неизвестной. Однако в случае ацетилхолинэстеразы можно выдвинуть веские теоретические соображения, связанные с ролью гидрофобных взаимодействий в стабилизации комплекса фермент — ацетилхолин (рис. 81). Так как при снижении температуры примерно от комнатной температуры до 0°С гидрофобные взаимодействия ослабевают, есть основания полагать, что для того или иного варианта ацетилхолинэстеразы сушествует критическая температура, при которой ослабление гидрофобных связей между ферментом и субстратом приводит к резкому подъему кажущейся величины Км для субстрата. [c.275]

Как известно, элементарный акт катализа осуществляется в активном центре фермента спонтанно, когда в нем достигается реакционноспособная конфигурация между реагирующими группами субстрата и фермента, расположенными на расстояниях порядка длин химических связей. На стадиях взаимодействия субстрата и фермента при образовании активной конфигурации и затем при отщеплении образовавшегося продукта в ферменте происходят конформационные изменения. Такие внешние факторы, как температура, ионная сила раствора, вязкость, могут влиять на эти релаксационные стадии. Однако непосредственный акт катализа в сформированной активной конфигурации уже не требует тепловой энергии активации. [c.221]

Вследствие этого создается конформационно-неравновесное состояние, которое релаксирует к новому равновесию с образованием продукта. Процесс релаксации происходит медленно и носит направленный характер, включая стадии отщепления продукта и релаксации свободной молекулы фермента к исходному равновесному состоянию. Координата ферментативной реакции совпадает с координатой конформационной релаксации. Температура же влияет на конформационную подвижность, а не на число активных соударений свободных молекул реагентов, что просто не имеет места в уже сформированном фермент-субстратном комплексе. Вследствие больших различий в скоростях мы можем рассматривать отдельно быстрые электронные взаимодействия в активном центре, осуществляющиеся на коротких расстояниях, и более медленные конформационно-динамические изменения в белковой части. На первом этапе катализа стохастический характер динамики белковой глобулы фермента и диффузии субстрата к активному центру приводят к образованию строго определенной конфигурации, включающей функциональные группы фермента и химические связи субстрата. Например, в случае гидролиза пептидной связи для реакции необходима одновременная атака субстрата двумя группами активного центра - нуклеофильной и [c.127]

Биологические реакции идут только при определенных условиях при значениях pH, близких к нейтральному, и температурах, мало отличающихся от 300° К. Границы, в которых допустимы отклонения от этих условий, весьма узки. В органической химии для ускорения реакций их часто проводят в крайне кислотных или крайне щелочных условиях, применяя высокие температуры и мощные окислители или восстановители. В биологических системах, где между различными компонентами должно существовать тонкое равновесие, такие способы исключены, и быстрое достижение равновесия в нужный момент и в нужном месте обеспечивается участием катализаторов. Такие биокатализаторы называют ферментами. Они состоят либо целиком, либо в основном из белка. В состав небелковой части фермента могут входить металлические ионы и некоторые органические молекулы. Если последние обладают каталитической активностью, входя в активный центр фермента, их называют кофер-ментами. Небелковая часть фермента носит название простети-ческой группы. Как и все катализаторы, ферменты не изменяют условий равновесия, а лишь ускоряют достижение равновесия, обеспечивая ход реакции по более быстрому пути. Ферменты, как правило, высокоспецифичны, т. е. взаимодействуют только с одним или несколькими аналогичными соединениями, называемыми субстратами. Благодаря этому они ускоряют определенные реакции, не влияя на скорость других. Это свойство ферментов имеет существенное значение. Специфичность фер-мента, по-видимому, обусловлена его конформацией. [c.380]

В число основных факторов, определяющих начальную скорость ферментативной реакции, входят концентрация фермента и субстрата, pH и температура, наличие активаторов и ингибиторов, причем концентрация субстрата является одним из наиболее важных. График зависимости между начальной скоростью и концентрацией субстрата выражается в виде ветви равнобочной гиперболы. Краеугольным камнем ферментативной кинетики является теория Михаэлиса-Ментен о механизме взаимодействия фермента и субстрата через образование про.межуточного фермент-субстратного комплекса, что является исходным моментом самых современных концепций. Теория исходила из факта, что равновесие между ферментом и субстратом достигается быстрее, чем разрушается фермент-субстратный комплекс. Однако анализ, проведенный Бригсом и Холдейном, показал, что в любой момент реакции скорости образования и распада фермент-субстратного комплекса практически равны, то есть достигается стационарное состояние, в котором концентрация промежуточного соединения постоянна. На основании этого было предложено уравнение, выполняемое для многих механизмов реакций, катализируемых ферментами, которое на- [c.203]

Обращает на себя внимание необычно высокая положительная величина А5 для миозина (аденозинтрифосфатазы). Такое изменение энтропии, согласно результатам исследования Лейдлера, Оллета и Моралеса [1], объясняется по крайней мере двумя причинами а) нейтрализацией положительного и отрицательного зарядов при взаимодействии фермента с субстратом, сопровождающейся дегидратацией ионов б) существенными конформационными изменениями третичной структуры фермента при комплексообразовании. Исследование влияния температуры на скорость отдельных стадий ферментативной реакции базируется на теории переходного состояния. Согласно этой теории, взаимодействующие молекулы при их сближении образуют переходное состояние (переходный или активированный комплекс), причем между исходным и переходным состоянием устанавливается динамическое равновесие. Вместе с тем, переходный комплекс претерпевает непрерывное превращение с образованием продуктов реакции. С этой точки зрения простейшую ферментативную реакцию Е + З ЕЗ- Е + Р следует рассматривать как многостадийную [c.131]

Авторы использовали взаимодействие препаратов частично очищенных ферментов с диизопропилфторфосфатом, содержащим радиоактивный изотоп Р , и определяли степень снижения активности ферментов и фактическое количество присоединившихся молекул ингибитора (по Р ). Для учета неспецифического присоединения ингибитора к посторонним белкам проводилась реакция в условиях защиты фермента субстратом. При этом для холинэстеразы сыворотки крови лошади была получена величина Um 5-10 мин (температура 38°, pH 7,4). Возможно, что несколько меньшая величина Ум, полученная Коэном и сотрудниками, объясняется неполной защитой холинэстеразы субстратом от ингибирующего действия диизопро-пилфторфосфата (см. ниже). [c.167]

Способность фермента снижать АС+, вероятно, не является свойством, независимым от других его каталитических параметров. Например, как мы уже говорили в предположительном плане, повышенная каталитическая эффективность в смысле снижения ДС+, возможно, могла бы достигаться только за счет уменьшения эффективности на других этапах реакции — скажем, на этапе связывания субстрата. Поэтому отбор мог бы приводить к некоторому балансу между изменениями величин и изменениями во взаимодействиях ферментов с лигандами. Возможная степень снижения ДС могла бы определяться только после того, как фермент приобрел надлежащее сродство к субстрату. В заключение мы упомянем ряд нерешенных вопросов относительно роли изменений Д0+ в компенсации температурных эффектов. Играют ли такого рода изменения важную роль в эволюционной адаптации различных эктотермных видов Снижают ли ферменты эктотермных животных, акклимированных к холоду, величину ДС+ в большей степени, чем ферменты особей, акклимированных к теплу Может ли непосредственная компенсация температурных сдвигов интенсивности обмена осуществиться в результате мгновенных термически обусловленных изменений в каталитической эффективности фермента Этот последний вопрос, на который (как и на первые два вопроса) имеющиеся данные еще не позволяют ответить, подводит нас к рассмотрению второго свойства, важного с точки зрения эволюции ферментов,— способности их изменять свое сродство к субстратам при изменении температуры. [c.260]

Для того чтобы представить себе, какие типы стратегии могли бы использоваться морскими организмами при адаптации к очень больщим или (и) сильно меняющимся давлениям, полезно будет вспомнить некоторые из основных стратегических соображений , связанных с адаптацией к температуре. Мы подчеркивали, что у эктотермных организмов диапазон толерантности к те.мпературе может быть самым различным — от крайне узкой стенотермности до чрезвычайно широкой эвритермиости. Известно, что по крайней мере некоторые из представителей последней группы обладают значительной способностью поддерживать относительное постоянство параметров своих ключевых ферментов при изменениях температуры. Оказалось, что у эктотермных форм, у которых температура тела подвержена большим изменениям, это не сказывается отрицательно на взаимодействиях ферментов с лигандами. Напротив, у крайне стено-термных видов некоторые ферменты (например, ацетилхолинэстераза одной антарктической рыбы), ио-видимому, приспособлены для работы только в чрезвычайно узком диапазоне температур. Однако при той низкой температуре (—2°С), при которой существует эта рыба, активность ее ацетилхолинэстеразы достигает оптимального уровня, ио крайней мере по способности связывать субстрат. [c.331]

Совсем недавно было опубликовано сообщение о том, что стереоизо-мерные формы одного и того же полимера образуют ассоциаты, возникновение которых сопровождается резким снижением растворимости. Вата-набе и др. [204] обнаружили, что смешение разбавленных растворов изотактического и синдиотактического полиметилметакрилата в хорошем растворителе приводит к мгновенному образованию геля. Полученный гель давал картину резкой дифракции рентгеновских лучей и имел хорошо выраженную температуру плавления, на которой совершенно не сказывалось соотношение двух полимерных компонентов при смешении. На основе этих данных можно предположить, что из двух стереоизомерных полимеров образуется стехиометрический комплекс. Природа этого комплекса была выяснена Ликвори и др. [205]. Их результаты будут обсуждены в гл. VIII. Подобный вывод может быть сделан на основе данных, полученных Иошида и др. [206], о том, что смешение растворов поли-у-метил-L-глутамата и поли-у-метил-В-глутамата в диметилформамиде приводит к осаждению оптически неактивного материала, в каком бы соотношении оптически активные полимеры ни смешивались. Эти результаты имеют очень большое значение, так как они показывают, что характерное для специфического взаимодействия белков образование комплексов в соответствии со стереохимическими соотношениями (например, образование комплексов фермент-субстрат и антиген-антитело) не всегда ограничивается макромолекулами, возникающими в живых организмах. [c.84]

Впервые феномен адсорбции — элюции вирусов с эритроцитов (в частности, для вируса гриппа) был обнаружен Херстом [402, 403]. Было показано, что вирус гриппа адсорбируется поверхностью эритроцитов при температуре О— 25 и спонтанно элюируется с них при температуре 37° и выше Элюированный вирус не изменяется, тогда как эритроциты совершенно утрачивают способность как адсорбировать вирус, так и агглютинироваться. Херст объяснил это явление взаимодействием фермента вируса (неирами-нидазы) и субстрата, расположенного на поверхности восприимчивой клетки. [c.105]

Томас [97, 98] и Рафтери с сотр. [99—102] наблюдали уширение линий и изменение химических сдвигов сигналов метильных групп ацетамидных фрагментов этих ингибиторов и субстратов в присутствии лизоцима. Рафтери и сотр. изучили взаимодействие АГА, (АГА) 2, (АГА)з и (АГА) 4, а также а- и Р-метилглюкозидов с лизоцимом. Устанавливается равновесие Е+5 Е5, где Е и 5 — фермент и субстрат (ингибитор) соответственно, а Е8 — образованный ими комплекс. Константы диссоциации комплексов /Сз известны. Считается, что обмен свободных и связанных молекул происходит достаточно быстро. Поэтому наблюдаемый сигнал является усредненным. Его положение и полуширина — это средневзвешенные значения химических сдвигов и полуширин линий для обоих окружений в соответствии с молярным соотношением субстрат/фермент, которое всегда было не меньше 4. Однако в некоторых случаях приближение быстрого обмена не выполняется. Обмен оказывается слишком медленным, и его скорость зависит от pH и температуры. В частности, примечательно, что при медленном обмене сигнал ацетамидо-группы сильно уширен за счет не связанного с молекулярным движением вклада в кажущееся значение Тг. [c.389]

Разделение субклеточных компонентов начинается с разрушения клеточной стенки и плазматической мембраны. Для этой цели нрименяют гомогенизаторы. Растительные ткани, погруженные в специальную среду для растирания клеток, о которой речь пойдет ниже (берутся одинаковые весовые количества ткани и среды), растирают в течение 30—120 сек при максимальном числе оборотов. В результате такой обработки большинство клеток разрушается, по крайней мере в случае тканей, не имеющих волокнистого строения, а их содержимое высвобождается. Растирание, конечно, следует производить на холоду, для того чтобы свести к минимуму ферментативные изменения в гомогенате, обусловленные взаимодействием субстратов и ферментов, которые в неповрежденной клетке не имеют контакта друг с другом. Обычно подобную обработку проводят в холодной комнате или применяют ледяные бани (температура 2—4°). Хотя гомогенизатор очень удобен для работы, его применение связано со значительными нарушениями не только клеточных стенок, но также субклеточных компонентов. Такое растирание обычно приводит, например, к разрыву ядерных мембран и разрушению ядер. В связи с этим часто возникает необходимость в более мягких методах. Один из таких методов — растирание в стеклянном гомогенизаторе с неплотно подогнанным пестиком. Обработка в таком гомогенизаторе проводится в течение одной или нескольких минут путем вращения пестика со скоростью от ста до нескольких сотен оборотов в минуту. Еще более мягкая обработка — растирание пестиком в ступке вручную. Для разрушения клеток в условиях минимального повреждения компонентов очень удобен аппарат Ро и Чипчехиа [7]. В этом аппарате ткань проходит между вращающимися навстречу друг другу роликами, причем оболочка каждой клетки испытывает возрастаю- [c.10]

Возможны и другие процессы совместного влияния растворителей и температуры на активность ферментов. Так, к снижению ферментативной активности может привести усиление взаимодействия между молекулами воды и субстратами за счет образования водородных связей. Аналогичный эффект может вызвать и ассоциация молекул фермента в полимерные образования при пониженных температурах, происходящая из-за усиления ван-дер-ва-альсовых сил, например образование нерастворимых криоформ глобулинов ([625]. [c.237]

Кинетика ф ентативная — раздел химической кинетики, в котором изучаются закономерности зависимости скоростей реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ (субстратов, ферментов) и от условий взаимодействия (концентрации компонентов, pH среды, температуры, состава среды, действия активаторов, ингибиторов и т. д.). [c.108]

Особенностью механизма действия пероксидазы в оксидазных реакциях является способность фермента в процессе каталитической реакции генерировать свободные радикалы , HOj и радикал органического субстрата. Типичным субстратом в оксидазных реакциях пероксидазы является диоксифумаровая кислота [Saunders et al., 1964]. Оксидазное окисление ДФК исследовал Чанс, используя метод остановленной струи при pH 4 [ han e, 1952]. Было показано, что для проведения реакции при 4 °С требовалось присутствие ионов марганца, однако повышение температуры способствовало протеканию реакции и в отсутствие ионов марганца. Для пероксидазы, активированной ионами марганца, Чанс определил константу взаимодействия с кислородом (10 М сек ), и показал, что образующийся комплекс ПО-О реагирует с ДФК, с константой равной 4 10 М сек . [c.33]

Механизм функционирования галоалкандегалогеназы. Авторы ряда работ применили рентгеновскую кристаллографию к изучению механизма каталитического акта галоалкандегалогеназы (табл. 1.10) [503 -505]. Трехмерные структуры фермента, монокристалл которого постоянно находится в маточном растворе, были расшифрованы по картам электронной плотности, рассчитанным по дифракциям образца в отсутствие и в присутствии субстрата 1,2-дихлорэтана [504]. При pH 5 и 4°, условии, далеком от оптимального, (pH 8,2 и 22°), субстрат связывался с активным центром, однако развития каталитической реакции не происходило. Образовавшийся невалентный фермент-субстратный комплекс Михаэлиса оставался стабильным как угодно долго, и поэтому его структура могла быть определена при использовании излучения рентгеновской трубки, экспозиции в 48 ч и сохранении всех других условий анализа нативного фермента. Найденное расположение субстрата в активном центре в схематической форме представлено на рис. 1.39. Один атом хлора ( lj) в комплексе располагается на расстояниях 3,6 и 3,2 A от атомов азота боковых цепей Тгр-125 и Тгр-175 и взаимодействует с водородами двух связей N-H. Другой атом хлора ( I2) стабилизирован дисперсионными взаимодействиями с бензольными кольцами Phe-128 и Phe-172. В найденной конформации субстрата в активном центре атом углерода С] сближен с кислородом 0° боковой цепи Asp-124 (3,8 А), что главным образом и обусловливает продуктивность невалентного комплекса. При нагревании кристаллического образца до комнатной температуры происходит разрыв связи С]-С1], [c.148]

Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы- предварительное разделение активностей NPT-II и АТРазы. Для этого разработан ряд методов, наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов протеиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из прибора и уравновещивают соответствующим буфером, который используют для проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами и субстратами это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы, плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем npoj мывают, как описано выще, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1 нг активного фермента, но значительно снижается при использовании неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8). [c.347]

В результате целого набора взаимодействий между отдельны- ми частями полипептидной цепи, в которых определенную роль играет и растворитель, фермент принимает специфическую активную конформацию и способен эффективно осуществлять превращение субстрата Однако, если условия окружающей среды изменяются таким образом, что часть из этих взаимодействий нарушается или отсутствует, нативная конформация молекулы существенно меняется, при этом способность фермента осуществлять каталитическое превращение субстрата падает. Такой Процесс называют денатурацией. Факторами, вызывающими денатурацию, мовут являться повышение температуры, изменение pH, введение химических агентов (мочевины, солей гуанидина и др.), механическое воздейетвие. В более широком плане можно говорить об инактивации ферментов, т. е. потери ими каталитической способности, которая может быть обусловлена как денатурацией, так и химической модификацией отдельных функциональных групп молекул фермента. [c.57]

ЛИТЬ по образованию продуктов катализируемой им реакции. Большинство используемых ферментных меток способно за 1 мин при обычных температуре и давлении превращать в продукты 10 молекул субстрата в расчете на одну молекулу фермента. Каталитическая эффективность фермента сильно зависит от его трехмерной структуры (конформации), Пространственная структура фермента, как и любого белка, поддерживается многочисленными нековалентными взаимодействиями, такими, как гидрофобные и водородные связи, ионные контакты, а также ковалентными дисульфидными связями. Трехмерная структура фермента обеспечивает близкое соседство определенных аминокислотных остатков в положениях, наиболее выгодных для осуществления катализа. Нековалентные химические связи непрочны и легко разрушаются или ослабляются под влиянием тепловой энергии или дополнительных нековалентных взаимодействий, возникающих, например, при связывании ионов, хао-тропных агентов, детергентов, липидов и т. д. Известно, что присоединение к ферменту другой молекулы (скажем, аллосте-рического эффектора) в области, удаленной от активного центра (т. е. каталитического центра), может вызвать конформацион-ную перестройку, изменяющую пространственное расположение аминокислотных остатков в этом центре. Изменения в некова- лентных взаимодействиях, приводящие к новой, необычной конформации фермента, способны существенно повлиять на каталитическую активность. Подобная конформационная гибкость становится одной из помех при использовании фермента в качестве метки. Однако эта же гибкость полезна для разработки иммуноферментного анализа без разделения компонентов, основанного на вызываемых антителами изменениях в конформации конъюгата [лиганд — фермент]. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в их молекулах многочисленных функциональных групп (аминогрупп, сульфгидрильных, карбоксильных, карбамоильных, остатков тирозина), через которые можно ковалентно присоединять молекулы лигандов. [c.12]

Ферментативная активность зависит от концентраций субстрата (или субстратов), активаторов и ингибиторов, специфичных для данного фермента, и от неспецифических влияний таких соединений, как соли и компоненты буфера, а также от pH, ионной силы и температуры, а иногда и от взаимодействий с другими белками или компонентами мембран, которые могут присутствовать в реакционной смеси. Обычно стремятся создать оптимальные условия для протекания ферментативной реакции, с тем чтобы фермент проявлял мак симальную активность (Vmax). Однако ЭТО не всегда возможно либо из-за слишком высокой стоимости субстрата или его плохой растворимости, либо потому, что оптимальные условия для данного фермента несовместимы с условиями, необходимыми для другого (сопрягающего) фермента, без которого нельзя определить активность исследуемого фермента. Эти условия будут рассмотрены ниже. [c.277]

Подавляющее большинство процессов в клетке - ферментативные. Жизнь протекает при "низких" температурах, и без участия катализаторов химические превращения просто не могут происходить со скоростями, необходимыми Для осуществления сложных реакций, с разрывом прочных ковалентных связей. Регуляция мощного каталитического потенциала клетки достигается двумя принципиально разными путями изменением количества ферментов и активности последних. На активность фермента влияет количество доступного субстрата, 1 13ико-химические параметры среды и взаимодействие с особыми метаболитами, называемыми модуляторами. Ферменты, активность которых зависит от модуляторов, называют регуляторными. Они имеют для связывания субстрата центр, где протекает акт катализа, и еще один участок, называемый аллостерическим, для присоединения регулятора. Аллостерический путь регулирования обеспечивает "тонкую" настройку метаболизма в соответствии с изменяющимися условиями среды, и она осуществляется почти "мгновенно". [c.14]