Ферменты аналитические определение

В фармацевтической промышленности, фарманализе и медицине ферменты часто применяют в качестве аналитических реагентов. Для ферментативного анализа характерны безвредность и высокая специфичность. Например, для определения глюкозы в биологических жидкостях и тканях используется глюкозоокси-даза. Глюкозооксидазный метод, в отличие от химических, обеспечивает высокоселективное окисление глюкозы в биологических растворах [c.323]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Уреаза катализирует гидролитическое расщепление мочевины с образованием двух молекул аммиака и молекулы угле-кислого газа и может использоваться для аналитического определения мочевины. Недавно было показано, что с каждой молекулой уреазы (мол. вес 105 000) связаны два атома никеля . Наличие в молекуле уреазы тюна металла не было ранее обнаружено, хотя на это указывало наличие в спектре поглощения очищенного фермента простирающегося в видимую область хвоста с плечом при 425 нм и небольшими максимумами при 725 и 1060 нм. [c.41]

Гидролиз мочевины в мягких условиях катализируется ферментом уреазой ферментативный гидролиз применяют для аналитического определения концентрации мочевины. Продуктами гидролиза в нейтральных условиях в зависимости от применяемого буфера служат бикарбонат аммония или карбамат аммония [128. [c.572]

Интересна задача определения следов металлов, являющихся ингибиторами или активаторами ферментов. Аналитическая чувствительность таких реакций позволит определять 10- г/л металла [315]. [c.141]

Применение иммобилизованных ферментов, позволяющих проводить массовые химические анализы в отдельных пробах или в потоке (с многократным использованием одного и того же препарата фермента), в значительной степени снимает проблему высокой стоимости ферментных методов анализа и зачастую повышает точность аналитического метода. Существуют два общих подхода к аналитическому определению концентрации реагентов (субстратов) в исследуемой системе. В одном из них ферментативную реакцию доводят до полного израсходования определяемого вещества (или до установления в системе равновесия между исходными реагентами и продуктами реакции), регистрируя при этом изменение какого-либо подходящего физического или химического свойства системы, и по количеству образовавшегося продукта рассчитывают количество субстрата в исходном образце. Во втором подходе используют кинетические методы анализа для определения скорости появления продукта или исчезновения субстрата в ферментативной реакции и вычисление исходной концентрации субстрата по соответствующей калибровочной кривой. Этот метод применим также для определения концентрации эффекторов (ингибиторов или активаторов), присутствующих в реакционной системе. Оба данных подхода были реализованы на практике с применением иммобилизованных ферментов. [c.16]

Из полученной эмпирической модели следует, что главные и квадратичные эффекты наблюдаются для факторов pH, концентрации ФДА и концентрации фермента ЦП. Кроме того, существует статистически значимый эффект взаимодействия факторов концентрации субстрата (ФДА) и фермента (ЦП). С точки зрения аналитической химии это означает, что для определения фермента концентрацию субстрата следует контролировать как можно более строго. [c.509]

Биохимия не только использует в своих целях методы, созданные в рамках других химических дисциплин, но и вооружает химию новыми методами, основанными на применении биополимеров как инструмента химического исследования. Ферменты часто позволяют с уникальной, недоступной обычным химическим приемам избирательностью провести анализ сложных реакционных смесей, осуществить химические превращения в мягких условиях, избегая побочных реакций и побочных продуктов. Большое значение для решения тонких аналитических задач приобрели иммунохимические методы, использующие в качестве инструмента анализа антитела — белки, вырабатываемые высшими живыми организмами в ответ на введение чужеродных веществ. Антитела обладают способностью избирательно взаимодействовать именно с этими, вызвавшими иммунный ответ веществами и могут поэтому использоваться для их определения в сложных смесях. [c.10]

Кроме того, ферменты применяют в качестве аналитических реагентов для оценки фармакологических препаратов. Широкое применение получил метод определения глюкозы в крови при помощи фермента глюкозооксидазы [c.89]

Изменение характера роста бактерий под действием цианида калия, обусловленное снижением активности ферментов, можно использовать в качестве аналитического сигнала при его определении количественным или полуколичественным апособом. [c.33]

Вопрос существенно осложняется, когда невозможно получить и исследовать индивидуальные ферменты, что пока является наиболее обычным случаем в энзимологии. Известное упрощение достигается, если фермент содержит в каталитическом центре в стехиометрическом количестве какой-либо кофермент (обязательный кофактор ферментативной реакции), который может быть определен аналитическими методами. Таким способом может быть измерена молярная концентрация фермента (соответственно, каталитических центров) в изучаемом неиндивидуальном ферментном препарате. [c.57]

Использование такой схемы для классификации действия природных ингибиторов на рост биотестов представляется более целесообразным, чем построение и анализ кривых ингибирования по типу фермент — ингибитор, которые обычно применяют для опытов. Все данные, полученные аналитически или путем промеров, обработаны статистически, с вычислением средней квадратичной ошибки и определением процента отклонения от средней величины (Кефели, Турецкая, 1966). Для установления достоверности разницы между вариантами применялся критерий t, определенный по таблицам Стьюдента. [c.49]

Содержаиие понятий биохимия и гбиоорганиче-ская химия в известной степени условно. Здесь говорится о них лишь с единственной целью — проследить пути развития исследований, направленных на выяснение как субстанционального состава растительных и животных тканей, так и химических процессов, происходящих в организме. Такие исследования осуществлялись и чистыми химиками-органиками, и биохимиками, и даже медиками. У каждой из этих трех групп специалистов были свои цели. Хи-миков-органиков увлекали перспективы синтеза все более сложных веществ путем конструирования их молекул с целью показа возможностей искусственного получения аналогов органических соединений, образующихся в живых организмах. Биологи преследовали цели изучения субстратной и функциональной основ живого. Медики стремились выяснить границы между нормой и патологией в организмах. Объединяющим же началом всех этих исследований является не столько объект — живой организм, сколько аналитический путь исследования — от живого организма к изучению веществ, а затем и процессов, его составляющих. Здесь важно подчеркнуть и еще одно обстоятельство, связанное с темой настоящей книги, а именно появление на определенной ступени развития биохимии идеи о ведущей роли ферментов, а затем еще шире биорегуляторов, н процессе жизнедеятельности. В конечном итоге эта руководящая [c.174]

Для этого жидкую сыворотку замораживают в стеклянной чаш- ке и помещают в вакуум-эксикатор, который при помощи стеклян- ной трубки по возможности большого диаметра соединяют через охлаждаемую ловушку с масляным вакуум-насосом. В зависимости от вакуума, который должен достигать не менее 10 мм рт. ст., через несколько часов (или дней) сыворотка полностью высыхает. Активность полученного препар-ата перед использованием его для аналитических целей определяют любым стандартным методом, например электрометрическим ДрН-методом. Построение калибровочной кривой и само определение проводят с растворами ферментов равной активности. [c.174]

В гл. III рассматриваются методы, в которых используются каталитические реакции. Последние, особенно в случае биологических катализаторов — ферментов, часто оказываются достаточно селективными и обладают высокой чувствительностью при определении следовых количеств катализатора. Специфичность, которая во многих случаях может исключить предварительное разделение веществ, в сочетании с высокой чувствительностью дает идеальное решение ряда аналитических задач. Мы попытались сделать большой литературный обзор по аналитическому применению каталитических реакций, чтобы показать, насколько широко они используются в аналитической химии. [c.7]

Попадание паратиона в организм теплокровного животного может осуществляться через рот, дыхательные пути и кожу, а также через слизистые оболочки. Паратион, проникший в организм [323], проявляет себя как сильнейший яд для ферментов. Лучше всего исследовано его ингибирующее действие на холинэстеразы. Эти ферменты управляют в организме, например в нервных клетках теплокровных (и насекомых), жизненно важными процессами. Блокирование холинэстеразы паратионом и другими фосфорорганическими инсектицидами настолько характерно, что для контроля лиц, работающих с паратионом или другими инсектицидными соединениями фосфора, применяют аналитический метод определения холинэстераз-ной активности в крови людей [46, 151, 257]. Для судебного доказательства интоксикации паратионом и аналогично действующими инсектицидами также используют определение холинэстеразной активности [931]. [c.63]

Среди ферментов медицинского назначения иммобилизованной уре-азе отводится ответе векная роль в сложной системе регенерации диализата в аппарате Искусственная почка , который применяют во время сложньге хирургических операций. Катализируя гидролиз мочевины до аммиака и углекислоты, уреаза активно способствует очистке крови от токс1тчтп.тх веществ. Данный препарат имеет растительную природу и не уступает зарубежным образцам. Уреазу можно также использовать при аналитическом определении мочевины и тяжелых металлов [18, 19, 44]. [c.183]

Иммуноферментвый анализ (ИФА) является в настоящее время одним из наиболее активно развивающихся направлений аналитической биохимии. В этом методе высокая чувствительность определения ферментной метки (менее 10 М) сочетается с уникальной специфичностью иммунохимического анализа. Достижению высокой чувствительности ИФА способствует использование различных инструментальных методов для регистрации активности ферментов — спектрофотометрических, флуориметрических, хеми- и биолюминесцентных, электрохимических. [c.115]

До сих пор не известно, в каких именно реакциях принимают участие жирорастворимые витамины в организме. Они входят в состав ферментов, и, по-видимому, их действие связано с действием ферментов. Поскольку витамин А является сильно ненасыщенным соединением (в его молекуле содержится система сопряженных двойных связей), он легко дезактивируется под действием окислителей. Витамин О содержит три двойные связи и гидроксильную группу. Его биологическая активность не уменьшается с повышением температуры, как можно было бы ожидать на основании его строения. Витамины А и О с треххлористой сурьмой дают окрашенное в голубой цвет соединение. Эта реакция используется для аналитических целей. Витамин Е быстро превращается в неактивную форму в присутствии окислителей и на свету. В этих условиях разрушается кислородсодержащее кольцо токоферола. Витамин Е устойчив к нагреванию в отсутствие воздуха. При окислении витамина Е азотной кислотой образуются продукты, окрашенные в красный цвет (аналитический метод определения витамина Е). Витамин К, содержащий кольцо нафтохинона-1,4, принимает участие в реакциях окисления — восстановления. Он разрушается под действием кислот, спиртовых растворов щелочей и ультрафиолетовых лучей. При нагревании витамин К не изменяется. Витамин К не удается определить колориметрически. Определение этого витамина основано на изменении времени свертываемости крови цыплят в его присутствии. [c.308]

Соединения акридина вызвали значительный технический и научный интерес уже в 1871 г., когда Гребе [2] открыл акридин в высококипящей фракции каменноугольной смолы. Соединения акридина послужили исходным материалом для получения обширного ряда оранжевых и желтых основных красителей, а также красных и пурпурных кубовых красителей. Некоторые из них широко применяются и до настояш,его времени. Кроме того, из соединений акридина получают многие важные химиотерапевтические препараты, которые различаются по своей сложности к числу, их относятся как простые моно- и диами-ноакридины (применяются для профилактики и лечения хронического сепсиса ран), так и более сложные производные, которые оказались эффективными при малярии и лямблиозе (хинакрин и акранил). Интерес к соединениям акридина вызывается еш,е и тем, что многие из них обладают сильной флуоресценцией, а некоторые, например диакридилы,—довольно редким свойством хеми-люминесценции ( холодное свечение ). Наконец, акридины применяют и в других разнообразных областях их используют в качестве ингибиторов коррозии, в качестве реагентов для получения некоторых ферментов и для аналитических определений. [c.373]

Изменения активности некоторых белков коррелируются, как правило, с изменениями ряда физических свойств. Так, изменение формы белковой молекулы можно установить по изменению некоторых гидродинамических характеристик (например, коэффициента трения, инкремента вязкости), по изменению светорассеяния, поверхностных свойств, диффузии через полупроницаемые мембраны и скорости седиментации [90]. Изменения термодинамических свойств (энтальпии и энтропии), объема, растворимости, оптического вращения, поглощения в инфракрасной области, дифракции электронов, а также некоторые другие характеристики, приведенные Каузманом [90], используются для Оцейки изменений формы белковых молекул. Большинство этих измерений было проведено па макромолекулах неизвестной структуры, для которых не была установлена последовательность аминокислотных остатков. В настоящее время благодаря усовершенствованию методов деградации белков, аналитического определения Концевых групп, методов разделения и идентификации отдельных фрагментов можно успешно изучать белки с молекулярным весом порядка 20 ООО. Хотя эта работа еще не достигла молекулярного уровня, тем не менее она дает возможность лучше использовать значения физических констант белковой молекулы известной структуры для объяснения механизма взаимодействия фермента с субстратом. Структура такого белка, как фиброин (белковое вещество натурального шелка), в настоящее время хорошо изучена благодаря сравнению рентгенограммы и ИК-спектров нативного волокна с рентгенограммами [35, 38, 108, 140] и ИК-спектрами [168] небольших фрагментов белка известной структуры, полученных при деградации, а также синтетитегаихпмшнептидо [c.386]

II. Как неоднократно подчеркивалось в этом разделе, кинетические затруднения в протекании гомогенных редокс-взаимодействий ограничивают выбор реа кций, пригодных для аналитических определений. В то же время эта особенность редокс-реакций послужила основой для разработки новых — кинетических — методов анализа [196, 197]. Исходным здесь является следующее положение если анализируемое вещество участвует в лимитирующей стадии процесса, о его концентрация обратно пропорциональна времени, необходимому для протекания реакции до заранее выбранной степени прёвращения. В работе [198] кинетическим методом с использованием оксредметрических измерений определены концентрации глюкозы. Под влиянием фермента глюкозооксидазы в анализируемой пробе происходит реакция [c.112]

Термин деформатор был введен для соединений, вызывающих локализованное, довольно ограниченное конформационное изменение в белке, полностью и легко обратимое при удалении этого соединения. Разным белкам соответствуют различные специфические деформаторы , и в литературе описаны многочисленные примеры ферментов, которые особенно чувствительны к специфическим катионам, анионам или незаряженным соединениям. Их влияние на структуру фермента часто выражается в обратимой инактивации последнего (изменение значений Кт или Кмакс, или И ТОЙ И другой величины), в изменении агрега-ционного состояния или констант связывания фермента с определенными лигандами. Такого рода соединения очень часто упоминаются в сообщениях об оптимизации методики определения активности данного фермента и относятся к неконкурентным ингибиторам, которые не должны присутствовать в аналитической пробе. Некоторые из этих соединений могут действовать как специфические деформаторы , вследствие чего следует провести скрининг с помощью пробного набора для определения их эффективности как элюентов. [c.184]

Аддукты подвергаются циклизации и в присутствии кислорода медленно превращаются во флуоресцирующий продукт. Эти реакции лежат в основе удобного аналитического метода определения NAD+ (с использованием 2-бутанона). Однако эти реакции могут приводить также к образованию ингибитора фермента, очень осложняющего работу присутствие следов ацетона в коммерческом препарате NADH приводит к искажению результатов экспериментального исследования [90]. [c.251]

Приготовление вытяжки фермента из растительного материала. Н аналитических весах взвешивают около 1 г ржаной муки свежего помола. Навеск переносят в фарфоровую ступку, добавляют немного битого стекла, 5 мл дистилл рованной воды и тщательно растирают. Растертую массу количественно перенос в мерную колбу емкостью 100 мл при помощи широкой воронки. Ступку, пестик воронку несколько раз споласкивают дистиллированной водой. Содержимое колб доводят водой до метки, тщательно встряхивают и оставляют на 3—4 ч настаиватьс при комнатной температуре. По истечении срока настаивания содержимое колб хорошо встряхивают и болтушку фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрг используют для определения тирозиназы. [c.112]

Благодаря высокой специфичности и способности окислять только р-О-глюкозу, даже находящуюся в смеси с другими сахарами, глюкозооксидаза нашла ряд применений как аналитический реактив. Фермент используют для определения глюкозы, особенно в сложных биологических системах. Таким образом, например, определяют глюкозу, содержащуюся в кукурузном сиропе, в некоторых других сладких сиропах, или появляющуюся при гидролизе лактозы. Этим путем устанавливают количество глюкозы в винах, обнаруживают ее в испорченном молоке. В основе методов лежит реакция образующейся при действии фермента перекиси водорода с орто-толидином орто-дианизином или другим хромогенным акцептором. Если этот реактив реагирует с Н2О2 в присутствии пероксидазы, то образуется окисленный хромогенный акцептор, интенсивность окраски которого и регистрируется [c.277]

Классификация по природе процессов, используемых для получения аналитического сигнала. Тест-методы могут быть разделены на физические, химические, биохимические и биологические. Физических методов немного, и они не играют большой роли в практике химического анализа. Биохимические методы обычно основаны на использовании ферментов и иммуносистем. Выделенные природные ферменты, особенно иммобилизованные, в известной мере приобретают свойства химических реагентов, поэтому, несмотря на специфику ферментов как химических соединений (особенности происхождения, условия хранения, время сохранения активности), ферментные методы можно отнести к химическим. Иммунометоды больше тяготеют к биологическим методам. Биологические методы, базирующиеся на использовании микроорганизмов, органов, тканей и даже высокоорганизованных организмов и целых популяций, упомянуты только в разделе, посвященном определению суммарных показателей (биотесты). [c.211]

Но особенно революционизирующее влияние на экспериментальные возможт ности биохимии оказало применение ферментов матричного биосинтеза, в первую очередь ДНК-полимераз. Аналитические возможности в биохимии нуклеиновых кислот неизмеримо возросли с появлением амплификации, т.е. размножстия молекул ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы. Применение прямой и обратной транскрипции позволило перенести многие методы, разработанные применительно к ДНК, на рибонуклеиновые кислоты (см. 7.6). [c.232]

И простого К частному и сложному наверняка является перспективным путем также и для химии ферментов. Коферменты сами по себе каталитически не активны, а апоферменты представляются химикуганалитику как класс белков, которые несущественно отличаются от других белков, за исключением каталитической активности. Видимо, их действие сосредоточено на довольно маленьких участках молекулы, которые до оих пор еще недоступны аналитической расшифровке. Если бы мы теперь из данных модельных опытов получили исходные положения для решения вопроса, какого вида могут быть эти активные места, то определенно исследование существенно облегчилось бы. Для достижения этой цели недостаточно найти отдельные ферментные модели, а необходимо в наиболее широком масштабе исследовать все их каталитические возможности. [c.13]

Нам хотелось бы обратить внимание читателя на целесообразность использования в реакционной хроматографии ферментативных методов ХОП [5]. Ферментативные методы начинают все шире применять в аналитической химии для решения разнообразных задач определения от простых ионов типа нитрата или фосфата до макромолекул. Ферментативные методы отличаются высокой селективностью, невысокой стоимостью, а также простотой отделения веществ и введения их в реакционную смесь [9—11].. Использование иммобилизованных ферментов в дохроматографических превращениях явля- [c.13]

Водородный ион (ион гидроксония). Когда говорят о водородном ионе в водном растворе, то под этим всегда следует понимать гидратированный ион водорода, т. е. ион гидроксония [НзО] и соответственно [Н904] . Из всех электролитических ионов он имеет наибольшее значение. Многочисленные процессы, протекающие в водных растворах, в сильной степени зависят от концентрации в них водородных ионов (точнее ионов гидроксония). Многие процессы каталитически ускоряются водородными ионами (ионами гидроксония), например, омыление эфира, инверсия тростникового сахара. Некоторые же реакции водородные ионы замедляют (например, упоминавшаяся ранее реакция разложения перекиси водорода). Особенно сильно зависят от концентрации водородных ионов процессы в живых организмах. Ничтожные изменения концентрации водородных ионов жидкостей, входящих в состав живых организмов, в очень сильной степени влияют на функцию ферментов, содержащихся в них. Поэтому в биологии приобрело большое значение определение концентрации водородных ионов. Водородные ионы осаждают многие коллоидные вещества. Это имеет значение также в аналитической химии так, существует правило, что осаждение веществ, легко образующих коллоидные растворы, следует производить по возможности из кислых растворов. [c.101]

В аналитических исследованиях в связи с иммобилизованными ферментами необходимо упомянуть ферментные электроды [21], ферментные термисторы [40] и ферменты, ковалентно связанные с полистиролом или найлоном для целей автоматического анализа [24, 46]. Гильбо [22], например, использовал ферментные электроды для определения глюкозы, мочевины, L-аминокислот, галактозы, ацетилхолина и дегидрогеназ. Ферхмеиты, связанные с капиллярными реакторами, использованы в соединении с автоанализатором фирмы Te hni on для анализа различных субстратов, таких как глюкоза, мочевина и мочевая кислота [55]. Гудзон и др. [20] описали применение иммобилизованной холинэстеразы для контроля воздуха и воды, для обнаружения ингибиторов фермента, таких, как пестициды. Система характеризуется чрезвычайной чувствительностью. Например, органофосфат параоксон может быть обнаружен в количествах 1 10 в воздухе и воде. [c.442]

Свойства. Аналог неотетразолия хлористого, отличающийся от него наличием двух метоксильных групп. Кристаллы в виде игл или желтый мелкокристаллический порошок. Температура плавления 245—247°С (с разлож.). Легко растворим в этиловом и метиловом спиртах и хлороформе, растворим в теплой воде, плохо растворим в холодной воде, практически не растворим в ледяной уксусной кислоте, диметилформамиде, ацетоне и диэтиловом эфире. Под действием редуктазных ферментов восстанавливается до диформазана синего цвета, практически нерастворимого в воде, с максимумом светопоглощения при 570 нм, Примене1 ие, В микроскопии для локализации и исследования окислительно-восстановительных ферментов [9, 12, 19] и в качестве витального красителя для определений всхожести семян. В гистохимии для выявления НАД-диафоразы Берстон, 388] и обнаружения 8Н- и 85-групп в тканевых белках [20], В аналитической химии для определения ос-кетостероидов [21] и сахаров. [c.367]

За изменением этого субстрата под влиянием фермента можно следить, пользуясь различными приемами. Наиболее простой способ сводится к чисто визуальному определению скорости растворения вещества в присутствии фермента. Именно на этом принципе основан разработанный Меттом в лаборатории И. П. Павлова способ определения пепсина в желудочном соке — определяется скорость растворения столбика денатурированного яичного белка в присутствии исследуемой жидкости. Можно также использовать различные химико-аналитические методы, позволяющие более точно определять количество субстрата, изменяющегося под влиянием фермента в единицу времени. [c.123]

Процесс взаимодействия ФОС с ХЭ представляет собой бимолекулярную реакцию [3] и, следовательно, для вычисления константы скорости ее необходимо экспериментальное определение изменения концентрации фермента и ингибитора в ходе реакции по времени. Это, однако, встречает трудности, так как мы не имеем фермента в индивидуальном состоянии и не имеем возмонлности выражать молярную концентрацию активных центров ХЭ и следить за ее изменением во время реакции. Помимо того, концентрация ФОС, вызывающая в течение короткого времени полное торможение активности фермента, столь мала, что для измерения ее изменений в ходе реакции нет подходящих аналитических методов. В целях преодоления этих трудностей нами были разработаны специальные методы, позволяющие изучать кинетику взаимодействия необратимых ингибиторов с ХЭ и вычислять константы скорости таких реакций [12]. С помощью этих методов было предпринято систематическое изучение специфической реакционноспособности ФОС. Исследование проведено совместными усилиями трех лабораторий по единому плану лаборатории М. И. Кабачника [c.428]

Рассмотрим возможность автоматизации хроматографического анализа ферментов на примере, заимствованном из статьи [42]. Авторы статьи провели хроматографическое разделение ферментов на автоматическом анализаторе фирмы Te hni on (рис. 8.22). В этом приборе используется пропорциональный насос Р с 12 пластмассовыми трубками различного диаметра. Буферный раствор из системы формирования градиента прокачивается в колонку через трубку 1. Разделение белков происходит в колонке К. Основная часть элюата из колонки поступает в коллектор фракций F и затем используется после окончания анализа. В процессе хроматографирования от основного потока элюата отделяется очень небольшая часть, которая поступает в три аналитические секции, где проводится определение основной фосфатазы, трансаминазы и всех белков. После определения основной фосфатазы часть элюата поступает через трубку 2 вместе с пузырьками воздуха, введенными через трубку 3, и субстратом из трубки 4 в аналитическую систему. В короткой стеклянной спирали М происходит тшательное смешивание водных растворов, полученная смесь проводится через термостат I, в котором при определенных условиях происходит расщепление субстрата. Чтобы реакция прервалась, к смеси через трубку 5 добавляется раствор соответствующего реагента. Через смесительную спираль результирующая смесь вводится в проточную кювету колориметра С и затем идет на оброс. Сигнал детектора записывается самописцем Z, фиксирующим концентрацию основной фосфатазы (I). На абсциссу наносятся номера фракций. Определение трансаминазы проводится аналогичным образом. Через трубки 6—9 подаются образец, воздух, субстрат и реагент соответственно. Окончательный продукт реакции проходит через колориметр Сг. Результирующая концентрация трансаминазы пропорциональна кривой III записываемой самописцем. Третья аналитическая система, регистрирующая суммарное содержание белков, несколько проще, чем две другие. Часть элюата поступает через трубку 10, воздух проводится через трубку 11, а реагент для обнаружения белков — через трубку 12. Растворы смешиваются в спирали М, полученная смесь поступает в проточную ячейку колориметра Сз. Содержание белков в смеси записьгеается в виде кривой II. [c.80]

Пример трудностей, связанных с дифференциальной емкостью, представлен Майерсом и Остеръянгом [31]. На рнс. 6.20, а показаны дифференциальные импульсные кривые 1 М НС1 в присутствии и в отсутствие 20 мкг/л As . На рис. 6.20,6 представлены полярограммы растворов, содержащих дополнительно поверхностно-активное вещество Тритон Х-100 (0,001%). As восстанавливается необратимо, поэтому на высоту пика может сильно влиять адсорбция поверхностно-активного вещества. Тритон Х-ЮО изменяет и дифференциальную е.мкость и вследствие этого ток заряжения. Если фоновая кривая изменяется неизвестным и непредсказуемым образом, то использование градуировочной кривой для определения вещества является конечно сомнительным. Влияние поверхностно-активных веществ на ток фона, кроме того, иллюстрируется рис. 6.21. Растворы пептона готовят из обработанных ферментом протеинов, они представляют довольно упрощенную модель аналитического образца со сложной матрицей поверхностно-активных соединений. Изменение тока заряжения должно серьезно мешать многим определениям. [c.412]

Если анализируемые частицы участвуют в лимитирующей стадии процесса, то их концентрация будет обратно пропорциональна времени, необходимому для протекания реакции до заранее выбранной степени. Однако при этом необходимо соблюдение двух условий 1) высокой ионной силы, что позволяет обойтись без введения поправок на изменения коэффициентов активности 2 - высокой концентрадии других компонентов, что позволяет пренебречь ее уменьшением. Пробы с неизвестной концентрацией можно анализировать, пользуясь калибровочной кривой или предварительно экспериментально определенным коэффициентом пропорциональности. Степень протекания реакции выбирают так, чтобы начальное и конечное значения аналитического параметра были удобны для измерения. Малмстадт и Пардю [75] использовали фиксированное изменение разности потенциалов между электродами в анализируемом и стандартном растворах. Они показали, что в интервале концентраций 5 — 500 мг/л глюкозу можно определить с относительной ошибкой 1%, используя ее окисление под действием фермента. Реакция протекает в две стадии глюкозоксидаза [c.76]

Все известные в настоящее время препараты ДНК, за исключением ДНК, выделенных из фагов, обладают полидисперсностью. Рассмотрим явление полидисперсности только по молекулярному весу. Большинство методов ( ракционирования, в том числе и применяемый автором, в определенной степени представляет фракционирование ДНК именно по этому параметру. Конечно, если при данном методе фракционирования после действия ионизирующей радиации появляется нли исчезает некая фракция ДНК, то это, несомненно, отражает сдвиги, происшедшие после лучевого воздействия. Наиболее полную информацию, вероятно, можно было бы получить, исследуя изменение полидисперсности ДНК (после того или иного воздействия) в аналитической ультрацентрифуге. Все-таки мне кажется, что нельзя связывать изменения в ДНК с непосредственным воздействием радиации in vivo. В последнем случае изменения в ДНК могут быть обусловлены вторичными эффектами, как, например, активация ферментов, изменение проницаемости оболочек, сдвиг в связи с этим ионного баланса и т. п. [c.84]

Метод рН-стата был использован для определения холинэстеразы Гликом [39] в 1938 г. обзор возможности его применения дан в работе Якобсена и др. [48]. Достоинства этого метода — его точность и чувствительность. Особое преимущество данного метода состоит в том, что он позволяет вести реакцию при различном pH, включая и те области pH, которые лежат за пределами возможности бикарбонатного буфера (с помощью манометрического метода измерение можно производить только в области этого буфера). При этом методе исключается также нежелательное изменение pH, характерное для дельта-рН-метода. рН-Статный метод более пригоден, чем манометрический для измерения активности фермента при низких концентрациях субстрата, так как в этих условиях вследствие быстрого расщепления субстрата реакция заканчивается за 5 мин, а только с помощью рН-статного метода можно регистрировать процесс немедленно после добавления субстрата. Другое преимущество этого метода перед манометрическим или методом дельта-рН состоит в том, что здесь нет помех со стороны буферных веществ. Его недостатком является сравнительно медленное выполнение измерения, а также то, что он таит в себе все технические и аналитические трудности, связанные с техникой титрометрии. [c.435]